- Điều kiện thực hiện thử nghiệm:
+ Labo thực hiện thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX:
* Được trang bị lọc HEPA. Lọc này chỉ cho phép những hạt có kích thước rất nhỏ ñi qua. Nó giữ lại tới 99,97 % các hạt có kích thước lớn hơn hoặc bằng 0,3 µm trong dòng không khí ñi qua lọc [64].
* Không khí trong phòng thay ñổi 60 lần/giờ.
* Phòng thí nghiệm ñược thiết kế bởi các chuyên gia phòng sạch của Singapo, ñảm bảo ñược các tiêu chuẩn của phòng sạch như: tường, sàn, trần nhẵn; chịu ñược các hoá chất khử trùng, tiệt trùng như nước javen, formaldehyde,...các góc ñược vê tròn tránh bám bụi.
* Có hệ thống ñiều khiển áp suất, nhiệt ñộ, ñộ ẩm. Áp suất trong phòng luôn cao hơn bên ngoài nhằm hạn chế không khí bẩn ñi vào phòng.
Nhiệt ñộ trong phòng duy trì ở 22 ± 20C, ñộ ẩm duy trì 60 ± 5 % nhằm hạn chế sự phát triển của VK và nấm.
* Quần áo mặc trong khi thực hiện thử nghiệm: may từ vải không sinh bụi.
+ Môi trường FTM, TSB ñược ñựng trong ống thuỷ tinh nút vặn của hãng Pyrex, chất lượng tốt, thuận tiện cho công việc và giảm ñược hiện tượng dương tính giả.
- Việc kiểm tra vô trùng VX ñã ñược chuyên môn hoá: thực hiện ở một labo, do cán bộ chuyên trách ñảm nhiệm. Điều này tiết kiệm ñược thời gian, công sức và tài chính.
- Thực hiện thêm một chứng âm của thử nghiệm vô trùng VX : giám sát môi trường phòng sạch trong khi thực hiện thử nghiệm. Việc thực hiện chứng âm rất quan trọng, nó nhằm loại trừ các trường hợp dương tính giả: dấu hiệu phát triển của VK hoặc nấm trong các ống môi trường nuôi cấy VX có thể do nhiễm từ ngoài vào trong quá trình thao tác chứ không phải do bản thân sản phẩm. Việc huỷ nhầm một loạt VX rất lãng phí do chí phí sản xuất rất cao và do chi phí phục vụ cho việc huỷ.
Các kết quả giám sát môi trường phòng sạch trong khi thực hiện thử nghiệm cũng như giám sát ñịnh kỳ cho thấy tủ cấy vô trùng ñạt tiêu chuẩn cấp ñộ A, phòng thực hiện thử nghiệm ñạt tiêu chuẩn phòng sạch cấp ñộ B, ñáp ứng tiêu chuẩn của WHO, Dược ñiển châu Âu, Mỹ,...về ñiều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng VX.
Hình 1.4: Bảng hiện thị máy ñếm hạt bụi Hình 1.5: Đầu thu mẫu máy ñếm vi khuẩn và nấm
1.4.5. Các tồn tại trong thử nghiệm vô trùng tại KĐQG
Mặc dù ñã có rất nhiều cải thiện trong những năm vừa qua nhưng thử nghiệm vô trùng VX tại KĐQG vẫn còn một số hạn chế:
Thứ nhất: Chưa thực hiện ñược hết các chứng dương của thử nghiệm vô trùng.
Trong ba chứng dương KĐQG mới chỉ thực hiện ñược một chứng dương là thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng của môi trường. Còn hai chứng dương là thử nghiệm ức chế và thử nghiệm duy trì chưa ñược thực hiện. Điều
này có thể dẫn ñến hiện tượng âm tính giả: VX nhiễm VK hoặc nấm nhưng không phát hiện ñược. Thể tích MT mà KĐQG ñang sử dụng ñể kiểm tra vô trùng VX chưa ñược khẳng ñịnh là có thích hợp với các VX hay không.
KĐQG phải kiểm tra vô trùng rất nhiều VX sản xuất trong nước cũng như VX nhập khẩu. Viện cần xác ñịnh thể tích MT ñể kiểm tra vô trùng từng VX, ñòi hỏi rất nhiều chi phí, thời gian, công sức. Thực tế ñòi hỏi phải có một qui trình chung ñể giảm ba yếu tố trên. Điều này KĐQG chưa thực hiện.
Thứ hai: Đối với các VX mà trong quá trình sản xuất có thực hiện công ñoạn nuôi cấy tế bào: chưa thực hiện thử nghiệm kiểm tra xem VX có bị nhiễm Mycoplasma hay không [75]. Công việc này ñang trong giai ñoạn triển khai và sẽ trở thành thường qui trong những năm sắp tới.
Chương 2:
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Môi trường FTM và TSB, sản xuất tại KĐQG từ môi trường bột của hãng
Merck, ñóng ống ở các thể tích khác nhau: 20 mL, 30 mL, 40 mL,...
- Số lượng ống môi trường của mỗi loại (FTM và TSB): 32 ống môi trường/thể tích. Trong ñó:
+ 20 ống dùng ñể kiểm tra khả năng mọc của chủng mẫu trong môi trường khi có mặt của VX bằng cách cho vào mỗi ống môi trường lượng VX giống như trong thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX và 10-100 CFU chủng mẫu.
+ 11 ống dùng ñể kiểm tra vô trùng và dinh dưỡng môi trường. + 1 ống dùng ñể kiểm tra vô trùng pi pét.
Các VX sử dụng trong nghiên cứu ñều ñược sản xuất với số lượng trên 500 lọ/loạt. 20 ống MT dùng kiểm tra khả năng mọc của chủng mẫu trong môi trường khi có mặt của VX là kết quả tính ñược theo Bảng 1.1 và 1.2 như sau: Bảng 2.1: Số lượng ống MT cần cho mỗi loạt của từng VX S T T Tên VX Thể tích mỗi lọ (mL) Số lọ VX cần KT vô trùng của mỗi loạt Lượng VX hút ra từ mỗi lọ (mL) Lượng VX cấy vào mỗi ống MT (mL) Số ống MT 1 OPV 2 20 2 1 20 TSB 20 FTM 2 BCG 2 20 2 1 20 TSB 20 FTM 3 VGB 1 40 1 1 20 TSB 20 FTM 4 VNNB 5 20 2 1 20 TSB 20 FTM
2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu
- Địa ñiểm nghiên cứu : tại Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế.
- Thời gian nghiên cứu: từ 3/2009-8/2010
2.3. Vật liệu
2.3.1. Môi trường, hóa chất
- Môi trường dùng ñể xác ñịnh thể tích: + FTM (Merck, 1.08191.0500); + TSB (Merck, 1.05459.0500);
+ Canh thang thường (Merck, 1.05443.0500); + BHB 15% glycerol (Merck, 1.10493.0500); + Thạch TSA (Merck, 1.05458.0500);
+ Thạch sabouraud 2% dextrose (Merck, 1.07315.0500). - Các dung dịch xác ñịnh hàm lượng thimerosal:
+ Dung dịch dithizon (Merck, 1.03092.0005);
+ Dung dịch acid sulfuric 1:1 (Merck, 1.00731.1000); + Dung dịch KMnO4 (Merck, 1.05082.0250);
+ Dung dịch acid acetic (Merck, 1.00063.1000);
+ Dung dịch hydroxylaminsunfat (Merck, 1.04617.0500); + Dung dịch NaCl (Merck, 1.06404.1000);
+ Dung dịch thủy ngân chuẩn (Merck, 1.70226.0500). - Các dung dịch xác ñịnh hàm lượng formaldehyde:
+ Thuốc thử acetylaceton (Merck, 1.096000.0100); + Dung dịch formaldehyd (Merck, 1.04003.1000).
2.3.2. Vắc xin
- Bốn VX lựa chọn trong nghiên cứu là những VX trong nhóm sử dụng nhiều
+ BCG: loạt số 104, 109, 115.
+ OPV: loạt số 6821009, 6831009, 6841009, 6851009, 6871010.
+ VGB: loạt số B-BR011207, B-BR010108, B-BR020508, B- BR030608, B-BR041008, B-BR051008, B-BR061208, B-BR071208, B- BR010409, B-BR020509, B-BR030609, B-BR040609, B-BR051009.
+ VNNB: loạt số 010208E, 020208E, 030408E, 040508E, 010108, 020808, 030808, 010609, 020709, 010209E, 020809E, 041009E.
- Số lượng lọ VX cần cho xác ñịnh thể tích MT ñược tính dựa vào các yếu
tố sau:
+ Số lượng VX cần cho một lần kiểm tra vô trùng của mỗi loạt sản xuất: theo qui ñịnh của TCYTTG tại tài liệu WHO TRS 530, annex 4 [70].
VGB là VX có thể tích mỗi lọ là 1 mL. OPV và BCG là VX có thể tích mỗi lọ là 2 mL. VNNB có thể tích 5 mL.
Các VX trong ñề tài ñều ñược sản xuất với số lượng lớn hơn 500 lọ/loạt nên số lượng dùng cho một lần kiểm tra vô trùng sẽ là 20 lọ ñối với OPV, BCG, VNNB; 40 lọ ñối với VGB (Bảng 2.1).
+ Số thể tích MT dự ñịnh thẩm ñịnh. Mỗi thể tích MT cấn số lượng VX bằng số lượng của một lần kiểm tra vô trùng.
+ Để kết quả tìm ñược có giá trị: thể tích MT tìm ñược cần khẳng ñịnh trên 3 loạt VX khác nhau.
Số lượng VX sử dụng cho xác ñịnh thể tích MT như sau:
Bảng 2.2: Số lượng VX sử dụng cho xác ñịnh thể tích MT Tên VX Số loạt Số thể tích MT thẩm ñịnh Số lượng mỗi loạt OPV 4 2 20 BCG 3 1 20 VGB 8 3 40
VNNB 8 5 20
- Số lọ VX cần cho một lần xác ñịnh hàm lượng thimerosal hoặc formaldehyd là 4 lọ/loạt ñối với VNNB, 20 lọ/loạt ñối với VGB.
2.3.3. Chủng mẫu
B. subtilis ATCC 6633,
C. albicans ATCC 10231, K. rihzophila ATCC 9341.
2.3.4. Trang thiết bị, dụng cụ
Tuýp thuỷ tinh Pyrex Φ18; 20; 22 và 24 mm; Pipet thủy tinh các loại: Pyrex, ñộ chính xác loại A; Tủ cấy vô trùng Steril Gard, Baker;
Lò hấp MLS-3020, Sanyo; Lò sấy UM400, Memmert;
Máy ño ñộ ñục Genesys 20, Thermo spectronic; Tủ -700
C Ultralow, Sanyo; Tủ -200C Vest frost, Denmark.; Tủ ấm MIR 162, Sanyo;
Tủ ấm MIR 251, Sanyo; Tủ lạnh Electrolux: 2-80
C, Sanyo; Máy lắc MS1 minishaker, IKA; Máy li tâm Labofuge, Heraeus;…
Tất cả trang thiết bị, dụng cụ sử dụng trong ñề tài (máy ñóng ống MT, các tủ ấm, tủ lạnh, tủ âm sâu, lò hấp, lò sấy tiệt trùng, pipét man, pipét thuỷ tinh,…) ñều ñược thẩm ñịnh, chuẩn ñịnh và cấp chứng nhận cho từng trang thiết bị, dụng cụ bởi Trung tâm Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam. KĐQG ñã thực hiện theo ISO 17025. Các tủ ấm, tủ lạnh, tủ âm sâu ñược theo dõi và ghi chép nhiệt ñộ hàng ngày, hai lần/ngày.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu: Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, nghiên cứu
mô tả 1 Không mọc Mọc Tăng thể tích MT, thực hiện thử nghiệm Đề xuất qui trình Kiểm tra vô trùng (Chứng âm) Chủng làm việc Chủng ñông khô
Thử nghiệm với thể tích hiện tại: 20 mL/ống Sản xuất môi trường
Thể tích thích hợp (mL)
Kiểm tra dinh dưỡng (Chứng dương)
Sơ ñồ 1: Sơ ñồ xác ñịnh thể tích MT
Nhắc lại thử nghiệm trên 2 loạt VX khác
100% số ống cấy VX
2.4.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác ñịnh thể tích MT thích hợp ñể kiểm tra vô trùng từng VX: + Thể tích FTM.
+ Thể tích TSB.
- Xác ñịnh hàm lượng thimerosal của các loạt VGB, VNNB KĐQG cấp giấy phép xuất xưởng trong 2 năm 2008-2009 (các loạt VX dùng xác ñịnh thể tích MT nằm trong 2 năm 2008-2009).
- Xác ñịnh hàm lượng formaldehyd của các loạt VGB, VNNB KĐQG cấp giấy phép xuất xưởng trong 2 năm 2008-2009 (các loạt VX dùng xác ñịnh thể tích MT nằm trong 2 năm 2008-2009).
2.4.3. Xác ñịnh thể tích môi trường
2.4.3.1. Chuẩn bị chủng làm việc
Từ một ống chủng gốc ở dạng ñông khô, nhân lên và chia làm nhiều tuýp, mỗi tuýp khoảng 1 mL, giữ trong môi trường BHB 15% glycerol ở – 800C làm chủng mẹ.
Chuẩn bị chủng làm việc: xác ñịnh nồng ñộ của huyền dịch trong mỗi ống chủng mẹ, pha loãng thành huyền dịch có nồng ñộ thích hợp cho việc kiểm tra chất lượng MT (khoảng 1000 CFU/0,1 mL) [2], [20], [24].
2.4.3.2. Pha chế MT
- Pha chế môi trường TSB và FTM theo tỷ lệ 30 g/lít.
Đóng ống theo các thể tích khác nhau: 20 mL, 30mL, 40 mL, 50 mL,… Hấp tiệt trùng 121o
C/15’.
- Pha chế các môi trường khác:
Pha chế thạch ñĩa TSA theo tỷ lệ 40 g thạch/lít, làm tan thạch, hấp tiệt trùng và ñổ ra các ñĩa ñường kính 9 cm.
Pha chế BHB 15% glycerol theo tỷ lệ 37g BHB + 150 mL glycerol cho 1 lít môi trường.
2.4.3.3. Tìm thể tích MT thích hợp với từng VX
- Các bước thực hiện
Mỗi VX ñược thực hiện qua theo hai bước chính như sau: + Bước 1: thẩm ñịnh với thể tích hiện tại: 20 mL.
+ Bước 2:
* Nếu thể tích hiện tại ñạt yêu cầu. Khẳng ñịnh thể tích trên với 2 loạt VX khác.
* Nếu thể tích hiện tại không ñạt yêu cầu, tăng thể tích MT lên 30 mL, 40 mL, 50 mL,... Thực hiện thử nghiệm ức chế.
Khi ñã tìm ñược thể tích thích hợp, khẳng ñịnh thể tích trên với 2 loạt VX khác.
- Nội dung thực hiện với mỗi thể tích MT: + Kiểm tra vô trùng loạt MT sử dụng:
* Lấy 2 % số ống MT của mỗi loạt nhưng ít nhất là 5 ống. * Ủ các ống FTM ở nhiệt ñộ 30-350C ít nhất 14 ngày. * Ủ các ống TSB ở nhiệt ñộ 20-250C ít nhất 14 ngày.
+ Kiểm tra dinh dưỡng loạt MT sử dụng:
* Số ống MT sử dụng: 6 ống môi trường FTM và 6 ống môi trường TSB mỗi loạt.
* Pha loãng chủng: pha loãng chủng bằng NMSL ñể có ñược huyền dịch với nồng ñộ thích hợp, thông thường khoảng 10-100 CFU/ 0,1 mL.
* Cấy chủng vào các ống môi trường: dùng pipet man cấy 0,1 mL các huyền dịch trên vào các ống môi trường, mỗi chủng cấy vào 2 ống FTM và 2 ống TSB.
Dùng pipet thuỷ tinh 1 mL ñể cấy VX vào các ống MT. Lượng VX cấy vào mỗi ống MT là 1 mL. Cách cấy giống như trong thử nghiệm vô trùng VX:
* Đối với FTM: ñưa sâu pipet xuống ñáy ống, vừa kéo pipet lên vừa nhả VX vào MT.
* Đối với TSB: nhỏ VX từ phía trên vào ống MT. + Cấy chủng mẫu vào các ống MT ñã cấy VX :
cho vào mỗi ống MT 10-100 CFU chủng mẫu (thông thường khoảng 0,1 mL huyền dịch chủng).
Số lượng ống MT của từng VX ñược chia cho 3 chủng.
Bảng 2.3: Số lượng ống MT của từng chủng mẫu ở mỗi thể tích MT Thể tích Tên chủng FTM TSB B. subtilis 6 ống 6 ống C. albicans 8 ống 8 ống K. rhizophila 6 ống 6 ống
+ Kiểm tra số lượng chủng mẫu ñã cấy vào mỗi ống MT bằng cách cấy ñếm trên ñĩa thạch TSA: mỗi chủng dùng hai ñĩa thạch, mỗi ñĩa 0,1 mL (ñúng bằng lượng ñã nhỏ vào mỗi ống MT).
+ Ủ các ống MT ở nhiệt ñộ thích hợp: 30-350C với MT cấy B. subtilis
và K. rhizophila, 20-250C với MT cấy C. albicans.
+ Đếm số khuẩn lạc trên các ñĩa thạch sau 24 - 48h. Tính số khuẩn lạc trung bình ñối với mỗi chủng.
2.4.3.4. Đánh giá kết quả xác ñịnh thể tích
- Thử nghiệm có giá trị nếu:
+ Loạt MT sử dụng ñạt yêu cầu vô trùng và dinh dưỡng.
* Đạt yêu cầu vô trùng: các ống dùng kiểm tra vô trùng MT không có dấu hiệu phát triển của VK và nấm: các ống FTM trong, không mất chỉ thị màu; các ống TSB trong, không có lắng cặn ở ñáy.
* Đạt yêu cầu về dinh dưỡng: B. subtilis và K. rhizophila trong các ống ñánh giá dinh dưỡng MT phát triển trong vòng 3 ngày, C. albicans trong các ống ñánh giá dinh dưỡng MT phát triển trong vòng 5 ngày.
+ Số khuẩn lạc trung bình ñếm ñược trên các ñĩa thạch ñối với mỗi chủng nằm trong khoảng 10-100.
Nếu số khuẩn lạc của một chủng nào ñó lớn hơn 100, làm lại thử nghiệm với chủng ñó.
Nếu số khuẩn lạc của một chủng nào ñó nhỏ hơn 10 nhưng vẫn có dấu hiệu phát triển của chủng trong các ống ñánh giá dinh dưỡng MT, thử nghiệm vẫn có giá trị.
Nếu số khuẩn lạc của một chủng nào ñó nhỏ hơn 10 và không có dấu hiệu phát triển của chủng trong các ống ñánh giá dinh dưỡng MT, thử nghiệm không có giá trị. Làm lại thử nghiệm với chủng ñó.
- Khả năng loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế (sự có mặt của VX không ảnh hưởng ñến sự phát triển của chủng mẫu): ñối với mỗi loạt VX
Tỷ lệ mọc của các chủng B. subtilis và K. rhizophila trong các ống MT cấy VX, ñánh giá trong vòng 3 ngày là 100%,
Tỷ lệ mọc của chủng C. albicans trong các ống MT cấy VX, ñánh giá trong vòng 5 ngày là 100%,
+ Sau 3 ngày các chủng B. subtilis và K. rhizophila không mọc hết ở 100% các ống MT, hoặc
+ Sau 5 ngày C. albicans không mọc hết ở 100% các ống MT: Tăng thể
tích MT và tiến hành thử nghiệm với các thể tích MT mới.
2.4.3.5. Đánh giá kết quả xác ñịnh thể tích
Thể tích MT thích hợp cho mỗi VX là thể tích mà trên ba loạt của VX ñó ñều ñạt yêu cầu loại bỏ ñược ảnh hưởng của chất ức chế.
2.4.4. Xác ñịnh hàm lượng thimerosal của các loạt VGB, VNNB