1.3.4.1. Các loại MT dùng trong kiểm tra vô trùng: TSB và các loại canh thang thioglycolat
Hầu hết các phòng thí nghiệm lớn trên thế giới cũng như KĐQG ñều dùng FTM và TSB làm MT nuôi cấy trong thử nghiệm vô trùng.
Thành phần của TSB (g/lít):
Pepton từ casein 17 Pepton từ soymeal 3
D(+) glucose 2,5
Sodium chloride 5 Di-potassium hydrogen phosphat 2,5 pH sau khi tiệt trùng là 7,3 ± 0,2 ở 250C.
TSB là một MT không có chất ức chế và chất chỉ thị, ñược dùng phổ biến. TSB giàu chất dinh dưỡng cơ bản, thích hợp cho việc nuôi cấy cả những VK khó tính. TSB ñược sử dụng ñể phát hiện nấm và các VK hiếu khí phát
triển chậm có trong VX. TSB còn ñược gọi dưới tên SCDM (Soya-bean casein digest medium) [51].
Để ñảm bảo cho sự phát triển của các VK hiếu khí và nấm, TSB cần ñược ñựng trong các ống sao cho thể tích của ống ít nhất phải gấp ñôi thể tích MT [67].
Thành phần của FTM (g/lít):
Pepton từ casein 15
Chiết xuất men 5
D(+) glucose 5,5 L-cystin 0,5 Sodium chlorid 2,5 Sodium thioglycolat 0,5 Sodium resazurin 0,001 Thạch 0,75
pH sau khi tiệt trùng là 7,1 ± 0,2 ở 250C
FTM ñược dùng phổ biến vì có nhiều chất dinh dưỡng, pH ổn ñịnh giúp cho hầu hết các vi sinh vật ñều có thể phát triển ñược, ñáp ứng ñược yêu cầu về dinh dưỡng.
Đặc biệt trong MT này có sodium thioglycolat và L-cystine, là những chất khử, giúp cho việc tạo ra ñiều kiện kỵ khí. FTM còn chứa một lượng thạch nhỏ, tạo một ñộ nhớt cao chống lại sự hấp thu nhanh oxy từ không khí, tạo ra ñiều kiện kỵ khí ở phía dưới của ống nên nó thích hợp cho cả VK kỵ khí. VK hiếu khí sẽ phát triển ở phía trên của ống MT và VK kỵ khí phát triển ở phía ñáy ống.
Hình 1.2: FTM Hình 1.3: TSB
Chất chỉ thị màu sodium resazurin là một chất oxy hóa khử, rất nhạy cảm với oxy nên dễ dàng phát hiện ñược các trường hợp có sự phát triển của VK và nấm trong MT và cho biết mức ñộ xâm nhập của oxy. Chiều cao của cột chỉ thị không quá 10% chiều cao cột MT [55]. Chiều cao này tăng lên theo thời gian và ñược khuyến cáo là không quá một phần ba chiều cao của cột MT ở cuối giai ñoạn nuôi cấy [43]. Để ñảm bảo ñiều này thì khoảng trống còn lại trong các ống ñựng FTM không ñược quá lớn. Trên thực tế làm việc tại KĐQG, ñể chứa 20 ml FTM thì nên dùng ống có ñường kính 18 mm hơn là dùng ống có ñường kính 20 mm.
Nhóm sulhydryl của sodium thioglycolat và L-cystine bất hoạt Asen, bạc và hợp chất của các kim loại nặng khác, vì vậy mà FTM thích hợp cho việc kiểm tra những chất liệu có chứa kim loại nặng hoặc chất bảo quản có thành phần kim loại nặng, VD: thimerosal.
Có nhiều loại canh thang thiglycolat dùng trong thử nghiệm vô trùng, loại thứ nhất là FTM như ñã nói ở trên, loại thứ hai là fluid thioglycolat medium G (FTMG), loại này có thành phần giống hệt FTM ngoại trừ thành phần thạch là thạch tổng hợp. FTMG trong hơn FTM, vì vậy nó ñặc biệt thích hợp cho việc kiểm tra vô trùng các VX có thể tích lọ lớn và nuôi cấy dài ngày.
Một loại canh thang thioglycolat nữa ñược sử dụng trong thử nghiệm vô trùng, ñó là MT thioglycolat thay thế (Alternative fluid thioglycollate
medium: AFTM), thành phần của AFTM giống như FTM nhưng không có thạch và reazurin [69].
1.3.4.2. Chất lượng và hạn sử dụng của môi trường
Chất lượng của MT phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong quá trình pha chế, hấp tiệt trùng,…Nhiệt ñộ và thời gian hấp có ảnh hưởng ñến tính vô trùng và dinh dưỡng của MT: khi hấp ở nhiệt ñộ quá thấp, MT có thể bị nhiễm trước khi ñưa ra sử dụng. Ngược lại, nếu hấp ở nhiệt ñộ quá cao và thời gian kéo dài sẽ làm hỏng ñường glucose có trong MT, không có lợi cho VK và nấm phát triển. Do ñó, MT ñược yêu cầu tiệt trùng bằng qui trình ñã ñược thẩm ñịnh. Cũng vì những lý do trên mà MT ñược yêu cầu kiểm tra chất lượng từng loạt một.
Sau khi tiệt trùng hai ngày, nếu không sử dụng ngay MT cần ñược bảo quản ở nhiệt ñộ từ 2-250C [43], [67], [69].
Hạn sử dụng của MT là một tháng sau khi pha chế nếu ñược ñựng trong các chai, tuýp không ñược hàn kín. Nếu MT ñược ñựng trong các lọ ñược hàn kín, hạn sử dụng của MT là một năm miễn là chúng ñược kiểm tra dinh dưỡng và chỉ thị màu ñạt yêu cầu. FTM ñược khuyên là không nên dùng nếu quá một phần ba trên của ống MT ñổi thành màu hồng [54], [69].
Trong thử nghiệm kiểm tra vô trùng, nếu các VX gây ñục MT thì sau 7 ngày nuôi cấy phải tiến hành cấy chuyển sang một ống MT khác. Viện Quốc gia về Sức khỏe và Môi trường Hà Lan khuyên trong hai lần kiểm tra ñó nên sử dụng cùng một loạt MT [54].