3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.4.1. Nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu
Thao tác cho máu vào buồng đếm:
- Hút máu vào ống pha loãng đến vạch 0.5, dung bông lau sạch máu dính ngoài ống
- Hút tiếp dung dịch pha loãng đến vạch 101.
- Lấy ống cao su ra, dung tay bịt 2 đầu, đảo nhẹ trộn đều máu.
- Đậy lamen lên buồng đếm, cho dung dịch huyết cầu đã pha loãng vào. Chú ý bỏ đi vài giọt đầu. Đợi 2-3 phút cho hồng cầu lắng xuống rồi đếm.
Phương pháp đếm hồng cầu:
Đếm hồng cầu ở 5 ô trung bình của khu vực đếm hồng cầu (vòng tròn đỏ trong Hình 2.4A). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ đếm tất cả những hồng cầu nằm gọn trong ô và những hồng cầu nằm ở cạnh trên và cạnh trái (Hình 2.4B).
Như vậy, biết được số lượng hồng cầu trong 80 ô nhỏ (mỗi ô là 1/400 mm2). Những hồng cầu nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, hồng cầu nằm giữa 2 vạch hoặc trên vạch thì đếm 1 tính 1.
A B
Hình 2.4: Phương pháp đếm hồng cầu và bạch cầu
(Chú thích: vòng tròn đỏ: khu vực đếm hồng cầu; vòng tròn xanh: khu vực đếm bạch cầu)
Cách tính kết quả:
Gọi A là tổng số hồng cầu đếm được trên 80 ô nhỏ, số hồng cầu trong buồng đếm là:
A x 4.000 x 200
Số hồng cầu trong 1mm3 = --- = A x 10.000 5 x 16
Trong đó:
4000 = 400×10 (1/400 mm2: diện tích 1 ô nhỏ, 1/10 mm:chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamen)
200: độ pha loãng mẫu máu
Phương pháp đếm bạch cầu
Hút máu đến vạch 0,5. Hút dung dịch pha loãng đến vạch 11; pha loãng 20 lần. Đếm 4 ô lớn ở 4 góc. Gọi N là số bạch cầu 4 ô lớn ở 4 góc.
Vậy số bạch cầu trong 1 mm3 là:
N/4 × 10 × 20 = N × 50
2.4.1.2. Định lượng huyết sắc tố bằng huyết sắc kế Shali[5]
Nguyên lý của phương pháp: Hb tác dụng với acid chlohydric (HCl) tạo ra acid haematin có màu nâu. Màu nâu này tỷ lệ thuận với lượng Hb có trong máu.
Cấu tạo của huyết sắc kế Shali gồm ống đo ở giữa, 2 ống mẫu hai bên. Ống mẫu màu vàng nâu tương đương với dung dịch Hb 1%. Ống xác định hình tròn, trên có 2 cột khắc độ: cột 1 chỉ số gam hemoglobin có trong 100ml máu; cột 2 chỉ số phần trăm (%) Hb.
Các bước:
Bước 1: Cho dung dịch HCl 1% vào ống đo đến vạch số 10, dùng ống hút hút máu đến vạch 20. Lấy bông lau sạch máu ngoài ống hút, cho ống hút
xuống tận đáy ống đo, thổi nhẹ cho máu chảy ra. Nên hút lên thổi xuống nhiều lần để rửa sạch máu trong ống hút rồi trộn đều.
Bước 2: Để yên 10 phút, pha loãng với nước cất đến lúc nào màu của ống đo và màu của ống mẫu bằng nhau thì dừng lại.
Bước 3: Đọc kết quả: đọc số gam trên ống đo đó là số gam Hb trong 100ml máu.
Lưu ý: cho acid chlohydric vào ít nhất phải đợi 10 phút rồi mới pha
loãng so màu, vì quá sớm sẽ ảnh hưởng đến kết quả. Sau khi cho acid chlohydric vào 1 phút thì chỉ 75% Hb chuyển thành acid hematin, sau 5 phút thì có 85%, sau 2 giờ đồng hồ mới được 100%.
Sau mỗi lần đo, dùng nước cất để rửa sạch ống đo.
2.4.1.3. Xác định protein tổng số trong huyết thanh bằng phản ứng Gornall [6]
Nguyên tắc: Protein tác dụng với đồng sunfat trong môi trường kiềm, cho phức chất màu tím bền vững. Trong điều kiện xác định, đậm độ màu của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
Dụng cụ: Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch Giá ống nghiệm Ống nghiệm to, nhỏ Quả bóp to, nhỏ Pipet nhỏ giọt Pipet 10ml Máy li tâm Micropipet 0,1ml
Máy quang kế (bước sóng 530 - 560nm)
Thuốc thử: Dung dịch Natrihydroxit bão hòa: (khoảng 18N) không lẫn carbonat, dung dịch Natrihydroxit 10% (theo thể tích) không lẫn carbonat, thuốc thử Biuret theo Gornall
Các bước:
Bước 1: Lấy máu đúng kỹ thuật.
Bước 2: Lấy huyết thanh không vỡ hồng cầu, dùng 2 ống nghiệm to: ống thử (T), ống trắng (Tr).
Bước 3: Hút chính xác 0,1 ml huyết thanh vào ống thử (T)
Bước 4: Hút chính xác 8ml thuốc thử Biuret vào ống thử, ống trắng
Bước 5: Hút tráng micropipet vào ống thử (lấy hết lượng huyết thanh) Bước 6: Lắc thật đều, để tiếp xúc 30 phút.
Bước 7: Đo máy quang kế (bước sóng 560nm), đối chiếu với nước cất. Bước 8: Tính kết quả dựa vào biểu đồ mẫu, hệ số protein, hoặc ống mẫu. Bước 9: Vẽ biểu đồ, tính kết quả.