3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.3.1. Thiết bị
Kính hiển vi (Olympus IX70, Japan); Máy ảnh kỹ thuật số (Pixera Pro 150ES, USA); Nồi hấp tiệt trùng (Su Zhou. Co); Máy li tâm (Pei Jing Co - LD5-2A); Máy đọc tiêu bản (Microplate Reader); Tiêu bản nuôi cấy 96 lỗ (Nunc, Denmark).
2.3.2. Hóa chất
Dịch nuôi cấy: Dịch nuôi cấy (khô) McCoy’s 5A (HyClone, Logan, UT) 12,0g, NaHCO3 2,2g, Heps 0,84g, penicillin 1 triệu đơn vị và streptomycin 100 mg dùng nước cất 2 lần hòa tan, đưa pH đạt: 7,2 – 7,4 cho thêm nước định mức lên 1000ml, lọc qua màng lọc millipore khử trùng, bảo quản dịch nuôi cấy trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC.
Collagenase (GIBCO BRL, USA)：100mg collagenase loại II hòa tan trong 20ml BSA – Hepes 0,1%, nồng độ 5mg/ml. Dùng màng lọc khủ trùng microporous lọc. Lưu ý: pha loãng 5 lần với dung dịch nuôi cấy trước khi sử dụng, bảo quản dịch nuôi cấy trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC.
0,2mol/l glutamine (Sigma): 1,46g bột hòa tan trong 50ml nước cất, lọc khử trùng, đóng gói, và sử dụng pha loãng 100 lần.
5g/ml transferrin (Sigma): 8,4g bột được hòa tan trong 3,76ml môi trường nuôi cấy, lọc qua bộ lọc millipore khử trùng, đóng gói và bảo quản, pha loãng 500 lần khi sử dụng.
3 x 10-8mol/l sodium selenite (Sigma): Na2SeO3 pha loãng với nồng độ 3 × 10-5mol/l, lọc qua bộ lọc millipore khử trùng, pha loãng 1000 lần khi sử dụng.
10g/ml insulin (Nanjing pharma Co, Ltd): pha loãng với nồng độ 1mg/ml, pha loãng 100 lần khi sử dụng.
5mg/ml MTT (Sigma): 10mg bột hòa tan trong 2ml môi trường nuôi cấy, lọc qua bộ lọc millipore khử trùng, đóng gói, bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
0,1mol/l PBS đệm: 8,5g NaCl, 35,8g Na2HPO4.12H2O2 và 15,6g NaH2PO4
.2H2O2 hòa tan trong 800ml nước cất, đưa pH đạt 7,4, thêm nước cho đến khi đạt 1000ml, sau đó hấp tiệt trùng, để nguội và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC.
4% formaldehyde cố định: 40g bột, hòa tan trong 500ml nước cất 2 lần đun cách thủy trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 55 - 60°C, ngoáy đều và đồng thời tiến hành nhỏ NaOH 1N sau khi thấy tan hết, cho thêm 500ml PBS 0,1mol/l để đạt được 1000ml formaldehyde 4% .
NaOH 1N : 4g bột hòa trong 100ml nước cất 2 lần.
100 IU/ml FSH: FSH bột (Ningbo Hormone Co.) 100 IU hòa trong 1 dung dịch nuôi cấy MCoy's5A 1ml.
Kháng thể đa dòng C-kit (Boster Co., Wuhan, China)
DAB hiện màu (Boster Co., Wuhan, China)
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu
Thao tác cho máu vào buồng đếm:
- Hút máu vào ống pha loãng đến vạch 0.5, dung bông lau sạch máu dính ngoài ống
- Hút tiếp dung dịch pha loãng đến vạch 101.
- Lấy ống cao su ra, dung tay bịt 2 đầu, đảo nhẹ trộn đều máu.
- Đậy lamen lên buồng đếm, cho dung dịch huyết cầu đã pha loãng vào. Chú ý bỏ đi vài giọt đầu. Đợi 2-3 phút cho hồng cầu lắng xuống rồi đếm.
Phương pháp đếm hồng cầu:
Đếm hồng cầu ở 5 ô trung bình của khu vực đếm hồng cầu (vòng tròn đỏ trong Hình 2.4A). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ đếm tất cả những hồng cầu nằm gọn trong ô và những hồng cầu nằm ở cạnh trên và cạnh trái (Hình 2.4B).
Như vậy, biết được số lượng hồng cầu trong 80 ô nhỏ (mỗi ô là 1/400 mm2). Những hồng cầu nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, hồng cầu nằm giữa 2 vạch hoặc trên vạch thì đếm 1 tính 1.
A B
Hình 2.4: Phương pháp đếm hồng cầu và bạch cầu
(Chú thích: vòng tròn đỏ: khu vực đếm hồng cầu; vòng tròn xanh: khu vực đếm bạch cầu)
Cách tính kết quả:
Gọi A là tổng số hồng cầu đếm được trên 80 ô nhỏ, số hồng cầu trong buồng đếm là:
A x 4.000 x 200
Số hồng cầu trong 1mm3 = --- = A x 10.000 5 x 16
Trong đó:
4000 = 400×10 (1/400 mm2: diện tích 1 ô nhỏ, 1/10 mm:chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamen)
200: độ pha loãng mẫu máu
Phương pháp đếm bạch cầu
Hút máu đến vạch 0,5. Hút dung dịch pha loãng đến vạch 11; pha loãng 20 lần. Đếm 4 ô lớn ở 4 góc. Gọi N là số bạch cầu 4 ô lớn ở 4 góc.
Vậy số bạch cầu trong 1 mm3 là:
N/4 × 10 × 20 = N × 50
2.4.1.2. Định lượng huyết sắc tố bằng huyết sắc kế Shali[5]
Nguyên lý của phương pháp: Hb tác dụng với acid chlohydric (HCl) tạo ra acid haematin có màu nâu. Màu nâu này tỷ lệ thuận với lượng Hb có trong máu.
Cấu tạo của huyết sắc kế Shali gồm ống đo ở giữa, 2 ống mẫu hai bên. Ống mẫu màu vàng nâu tương đương với dung dịch Hb 1%. Ống xác định hình tròn, trên có 2 cột khắc độ: cột 1 chỉ số gam hemoglobin có trong 100ml máu; cột 2 chỉ số phần trăm (%) Hb.
Các bước:
Bước 1: Cho dung dịch HCl 1% vào ống đo đến vạch số 10, dùng ống hút hút máu đến vạch 20. Lấy bông lau sạch máu ngoài ống hút, cho ống hút
xuống tận đáy ống đo, thổi nhẹ cho máu chảy ra. Nên hút lên thổi xuống nhiều lần để rửa sạch máu trong ống hút rồi trộn đều.
Bước 2: Để yên 10 phút, pha loãng với nước cất đến lúc nào màu của ống đo và màu của ống mẫu bằng nhau thì dừng lại.
Bước 3: Đọc kết quả: đọc số gam trên ống đo đó là số gam Hb trong 100ml máu.
Lưu ý: cho acid chlohydric vào ít nhất phải đợi 10 phút rồi mới pha
loãng so màu, vì quá sớm sẽ ảnh hưởng đến kết quả. Sau khi cho acid chlohydric vào 1 phút thì chỉ 75% Hb chuyển thành acid hematin, sau 5 phút thì có 85%, sau 2 giờ đồng hồ mới được 100%.
Sau mỗi lần đo, dùng nước cất để rửa sạch ống đo.
2.4.1.3. Xác định protein tổng số trong huyết thanh bằng phản ứng Gornall [6]
Nguyên tắc: Protein tác dụng với đồng sunfat trong môi trường kiềm, cho phức chất màu tím bền vững. Trong điều kiện xác định, đậm độ màu của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
Dụng cụ: Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch Giá ống nghiệm Ống nghiệm to, nhỏ Quả bóp to, nhỏ Pipet nhỏ giọt Pipet 10ml Máy li tâm Micropipet 0,1ml
Máy quang kế (bước sóng 530 - 560nm)
Thuốc thử: Dung dịch Natrihydroxit bão hòa: (khoảng 18N) không lẫn carbonat, dung dịch Natrihydroxit 10% (theo thể tích) không lẫn carbonat, thuốc thử Biuret theo Gornall
Các bước:
Bước 1: Lấy máu đúng kỹ thuật.
Bước 2: Lấy huyết thanh không vỡ hồng cầu, dùng 2 ống nghiệm to: ống thử (T), ống trắng (Tr).
Bước 3: Hút chính xác 0,1 ml huyết thanh vào ống thử (T)
Bước 4: Hút chính xác 8ml thuốc thử Biuret vào ống thử, ống trắng
Bước 5: Hút tráng micropipet vào ống thử (lấy hết lượng huyết thanh) Bước 6: Lắc thật đều, để tiếp xúc 30 phút.
Bước 7: Đo máy quang kế (bước sóng 560nm), đối chiếu với nước cất. Bước 8: Tính kết quả dựa vào biểu đồ mẫu, hệ số protein, hoặc ống mẫu. Bước 9: Vẽ biểu đồ, tính kết quả.
2.4.2. Phương pháp tách tế bào tinh hoàn
Tách: trứng gà được ấp đến 18 ngày tuổi để lấy tinh hoàn.
Làm sạch: loại bỏ màng ngoài tinh hoàn, rửa sạch trong dung dịch NaCl 0,9% từ 3 đến 4 lần nhằm loại bỏ các tế bào máu đỏ và các tạp chất.
Dùng kéo cắt nhỏ tinh hoàn cho đến khi đạt kích thước 1mm3.
Thủy phân bằng collagenase loại II 1mg/ml ở 370C, hai lần, mỗi lần 10 phút.
Lọc: dùng ống lọc có kích thước nhỏ 150m lọc tế bào tinh hoàn.
Ly tâm: dịch lọc được ly tâm ba lần (1000 vòng/phút trong 10 phút).
Điều chỉnh mật độ: dùng buồng đếm hồng cầu kiểm tra mật độ tế bào, mật độ đạt 50.000 tế bào/ml.
2.4.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào
Tế bào được nuôi cấy trong điều kiện 95% atm, 5% CO2 ở nhiệt độ 390C. Sau 16h nuôi cấy, các tế bào sinh sản bám chặt vào đáy của bản nuôi cấy, tiếp tục tiến hành đổi 0,5% FCS bằng dung dịch ITS (nhóm đối chứng)(có bổ sung 10μg/ml insulin, 5μg/ml transferrin và 3×10-8 M selenite) (Sigma, St. Louis, MO, USA). Nhóm này được dùng làm nhóm đối chứng.
Nhóm thí nghiệm bổ sung FSH (0,25 – 1,0 IU/ml) hoặc 2,4-D (25 - 100µg/ml). Các chất tiến hành nuôi cấy được hòa tan bằng cồn 100o (ethanol) tiếp tục được pha loãng với dung dịch McCoy’s 5A. Nồng độ cồn trong dung dịch nuôi cấy là ≤ 0,1%. Nhóm thí nghiệm được chấp nhận như là vật dẫn truyền.
2.4.4. Phương pháp hóa miễn dịch PCNA
Các tế bào sau 24 giờ nuôi cấy được cố định bằng 4% formaldehyte trong 30 phút để ở nhiệt độ phòng, sau đó được xử lý 3% H2O2 làm kiệt chất nội sinh peroxidase. Hóa miễn dịch học PCNA được sử dụng theo phương pháp của Jin và cs (2010) [25], sử dụng kháng thể đa dòng mouse anti-PCNA (Boster Co., Wuhan, China). Nhân của tế bào dương tính sẽ bắt mầu nâu nhạt. Chỉ số PCNA- LI được tính dựa trên tế bào có nhân màu nâu nhạt chia cho tổng số tế bào đếm được trong một ảnh chụp.
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi nhóm thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nhóm thí nghiệm được tra 4 lỗ, mỗi lỗ tiến hành chụp 4 ảnh. Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm SAS phiên bản 6.12, với độ tin cậy 95%.
d b b c aa c b b d 0 200 400 600 800 1000 ITS Ins Se Tf M
Yếu tố sinh trưởng (Growth factors)
S ố l ư ợng tế b ào (G erm c el l n um be r/ m m 2 ) 0 20 40 60 80 100 120 H oạ t t ính tế b ào (M T T ) (Cel l vi ab ili ty) (% o f co nt ro l ) Number M TT
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC DUNG DỊCH NUÔI CẤY KHÁC NHAU ĐẾN SINH SẢN CỦA TẾ BÀO TINH HOÀN NUÔI CẤY KHÁC NHAU ĐẾN SINH SẢN CỦA TẾ BÀO TINH HOÀN
Để đánh giá tác dụng và ảnh hưởng của các dung dịch nuôi cấy khác nhau đến sự sinh sản của tế bào tinh hoàn, chúng tôi tiến hành loại bỏ lần lượt từng yếu tố sinh trưởng, sau 48 giờ nuôi cấy chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các dung dịch nuôi cấy đến khả năng sinh
sản của tế bào tinh hoàn
Yếu tố bị loại bỏ Chỉ tiêu đánh
giá Không
loại bỏ Insulin Selenit Transferrin Mitogenic
Số lượng tế
bào/mm2 794,46 196,97 357,83 410,36 95,20
Hoạt tính tế
bào (%) 100 77,63 85,77 88,51 73,61
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của các dung dịch nuôi cấy khác nhau đến hoạt
tính và khả năng sinh sản của tế bào tinh hoàn.
(Chú thích: các chữ cái khác nhau trên mỗi cột thể hiện P < 0,05; các chữ cái giống nhau thể hiện P > 0,05)
Sau 48h nuôi cấy, không bổ sung các nhân tố thí nghiệm vào nhóm đối chứng, chúng tôi nhận thấy nhóm ITS có thể thúc đẩy khả năng sinh sản của tế bào tinh hoàn (P < 0.05, Biểu đồ 3.1). Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của tế bào tinh hoàn, nếu chỉ dùng dung dịch nuôi cấy tế bào thì khả năng sinh sản của tế bào rất thấp, đặc biệt trong trường hợp loại bỏ insulin ra khỏi môi trường nuôi cấy tế bào thì khả năng sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt, khả năng sinh sản của tế bào càng giảm đi nếu tiếp lục loại bỏ transferrin, selen ra khỏi dung dịch nuôi cấy. Tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của các dung dịch nuôi cấy khác nhau đến hoạt tính (MTT) và khả năng thúc đẩy sinh sản của tế bào tinh hoàn, so sánh với các nhân tố thí nghiệm khác cho thấy: dung dịch ITS có khả năng thúc đẩy khả năng sinh sản và hoạt tính của tế bào tinh hoàn, trong khi các nhân tố thí nghiệm khác có ảnh hưởng rất thấp đến khả năng sinh sản của tế bào tinh hoàn.
Huyết thanh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của tế bào động vật , do vậy thay thế hoặc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy có khả năng thúc đẩy khả năng sinh sản của tế bào động vật. Trong nuôi cấy tế bào, cần bổ sung các yếu tố sinh trưởng mitogenic, insulin và transferrin nhằm duy trì sự sống của tế bào mầm. Loại bỏ các nhân tố thí nghiệm ra khỏi dung dịch nuôi cấy ITS cũng gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của tế bào, nếu dung dịch insulin có mặt trong dung dịch môi trường nuôi cấy sẽ nhận thấy rõ ảnh hưởng của nó đến khả năng sinh sản của tế bào. Insulin có thể liên kết với các thụ thể trong màng tế bào kích hoạt các protein tyrosine kinase và tyrosine kinase protein thông qua đường dẫn truyền tín hiệu nội bào nhằm thúc đẩy sự phát triển của các tế bào thụ thể. Bên cạnh đó ta thấy, selen và transferrin cũng có vai trò quan trọng đối với khả năng sinh trưởng của tế bào tinh hoàn.
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA 2,4-D ĐẾN CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ, SINH HÓA MÁU VÀ SỰ SINH SẢN CỦA TẾ BÀO TINH HOÀN HÓA MÁU VÀ SỰ SINH SẢN CỦA TẾ BÀO TINH HOÀN
3.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D đến các chỉ tiêu sinh lý máu
Tiến hành tra 2,4-D ở các nồng độ 25 µg/ml, 50 µg/ml và 100 µg/ml và phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu ở phôi thai gà 18 ngày tuổi, sau 24 giờ nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D đến số lượng hồng cầu, bạch cầu và hàm lượng huyết sắc tố máu của phôi gà
Nồng độ 2,4-D (µg/ml) 0 25 50 100 Chỉ tiêu ±m CV% ±m CV% ±m CV% ±m CV% Hồng cầu (×106/ mm3) 2,80±0,06 5,85 2,75±0,08 6,21 2,65±0,10 6,30 2,57±0,13 7,6 Bạch cầu (nghìn/mm3) 24,35±0,25 8,53 25,63±1,64 15,23 26,57±1,56 19,71 27,43±1,75 18,15 Hemoglobin (g%) 9,45±0,25 12,00 8,74±0,53 13,26 8,01±0,36 13,45 6,95±0,52 14,32
Ở nồng độ 25 µg/ml, 2,4-D đã có tác động đến các chỉ tiêu sinh lý máu: Số lượng hồng cầu giảm nhưng chưa đáng kể (từ 2,8 triệu tế bào/mm3 xuống 2,75 triệu tế bào/mm3) (P > 0,05). Hàm lượng Hb giảm đi khá rõ rệt (từ 9,45g% xuống 8,74g%). Trong khi đó số lượng bạch cầu lại tăng lên rõ rệt từ 24,35 nghìn tế bào/mm3 lên 25,63 nghìn tế bào/mm3.
Sử dụng 2,4-D ở nồng độ 50µg/ml, số lượng hồng cầu đã giảm đi đáng kể còn 2,65 triệu tế bào/mm3, số lượng bạch cầu vẫn tiếp tục tăng. Còn hàm lượng Hb giảm đi rõ rệt.
Sử dụng 2,4-D ở nồng độ 100µg/ml, số lượng hồng cầu tiếp tục giảm nhưng không có sự chệnh lệch nhiều so với nồng độ 50 µg/ml, số lượng bạch cầu vẫn tăng, còn hàm lượng Hb thì có sự giảm sút mạnh (từ 8,01g% xuống 6,95 g%)
Như vậy có thể kết luận rằng 2,4-D có ảnh hưởng lớn đến các chỉ tiêu sinh lý máu. Ở nồng độ 25µg/ml, 2,4-D đã làm giảm số lượng hồng cầu và hàm lượng Hb. Đặc biệt là ở nồng độ 50 µg/ml gây ảnh hưởng rất lớn.
Lượng bạch cầu tăng lên chứng tỏ đã có đáp ứng miễn dịch để chống lại tác động của 2,4-D.
3.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D đến các chỉ tiêu sinh hóa máu
Albumin là thành phần chủ yếu cấu tạo nên protein huyết thanh. Chính vì vậy mà trong quá trình sinh trưởng và phát triển của động vật, hàm lượng tương đối hay tỷ lệ phần trăm của albumin thường biến động đồng thời với hàm lượng protein huyết thanh. Để đánh giá ảnh hưởng của 2,4-D đến các chỉ tiêu sinh hóa máu, chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu hàm lượng protein và các tiểu phần protein huyết thanh. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D đến hàm lượng protein và các tiểu phần protein huyết thanh (g/l)
Nồng độ 2,4-D (µg/ml) 0 25 50 100 Chỉ tiêu ±m Cv% ±m Cv% ±m Cv% ±m Cv% Protein toàn phần 50,54±1,45 8,60 50,01±1,56 8,75 49,25±1,89 8,95 49,01±1,56 9,25 Albumin 20,57±1,25 12,25 20,15±1,35 12,36 19,58±1,45 13,00 19,15±1,47 13,25