- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.3.9. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục (turbidimetric method).
(turbidimetric method).
Mục đích: Những vi sinh vật lactic là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này cần phải kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính đó, trong đó vi khuẩn E. coli và Salmonella được chọn làm vi sinh vật chỉ thị.
Nguyên tắc:
Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trưởng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sóng 610nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát.
Dựa trên khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm trao đổi chất của LAB đối với vi sinh vật chỉ thị trong môi trường lỏng. Vi sinh vật chỉ thị bị ức chế tăng trưởng dẫn đến nồng độ tế bào giảm so với đối chứng.
Ống đối chứng là sự phát triển bình thường của VK chỉ chị E. coli. Ống kiểm tra là ống có chứa dịch nuôi LAB đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng.
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức :
+ Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
+ Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB nhưng đã được loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N.
* Chuẩn bị :
Dịch nuôi cấy E.coli và Salmonella (ủ 21h, 370C) pha loãng 10-2 tương ứng nồng độ tế bào 105 tế bào/ml.
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS broth ủ kị khí 18- 24h, ở 37oC , mang 1 nửa đi trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1N, thanh trùng ở 80oC trong 10 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ sinh khối.
*Cách thực hiện:
- Ống thí nghiệm : gồm 1 ml dịch nuôi cấy E.coli hoặc Salmonella nồng độ 105 tế bào/ml với 1 ml dịch ly tâm LAB (trung hòa hoặc không trung hòa), bổ sung 8 ml môi trường cao thịt-peptone. Ủ hiếu khí 37oC, 24 giờ .
- Ống đối chứng : giống ống thí nghiệm, nhưng 1 ml dịch ly tâm LAB được thay bằng 1ml MRS broth đã tiệt trùng.
- Ống trắng : gồm 9 ml môi trường cao thịt-peptone và 1ml MRS broth đã tiệt trùng. Tiến hành đo độ đục của tất cả các ống bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610nm.
* Công thức tính toán:
Tỉ lệ sống sót của VSV chỉ thị (%) = ODTN/ODĐC*100 % OD = ODĐC / ODTN * 100%
Như vậy với %OD càng nhỏ thì khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó càng cao. Trong đó : ODĐC : giá trị OD của ống đối chứng
% vi sinh vật chỉ thị bị ức chế được tính như sau:
D% = 100% - %OD , thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D% càng lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao.
Chú ý: kết quả thu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê 95%.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN