Ph−ơng pháp phân loại vi nấm

2.3.3.1. Các nguyên tắc chung

- Chủng nấm tuyệt đối thuần khiết

- Sử dụng các môi tr−ờng, nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi cây đúng với quy định của các chuyên luận phân loại đối với từng chi (hoặc từng nhóm loài của chi).

- Quan sát và ghi chép đầy đủ các đặc điểm của các chủng vi nấm cần định loại (các đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi học).

31

- Dùng chuyên luận các nhóm phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ,) để phân loại đến chi. Sau đó dùng các chuyên luận phân loại của chi đã xác định để định loại đến loài (và thứ nếu có).

- Kiểm tra chủng vi nấm đã định loại với chủng mẫu của loài trong bộ s−u tập (nếu có).

- Viết tên các nhóm phân loại đúng danh pháp Quốc tế.

2.3.3.2. Quy trình định loại một chủng vi nấm * Các đặc điểm khuẩn lạc cần quan sát:

- Hình dạng, kích th−ớc, dạng mặt (m−ợt, mịn, len, xốp, dạng hạt…), mầu sắc trên và d−ới khuẩn lạc, mép khuẩn lạc (dầy, mỏng, phẳng, nhăn nheo)

- Giọt tiết (ít nhiều mầu sắc).

- Sắc tố hoà tan (mầu của môi tr−ờng xung quanh khuẩn lạc).

- Các cấu trúc khác nếu có (nh− bó sợi, bó giá, đệm nấm, hạch nấm, thể quả).

* Các đặc điểm vi học cần quan sát:

Sử dụng kớnh hiển vi quang học và kớnh hiển vi điện tử quột để quan sỏt, mụ tả cỏc đặc điểm hỡnh thỏi của vi nấm.

- Bào tử :

+ Kiểu phát sinh bào tử: Bào tử chia đốt (Arthroconidia), bào tử nảy chồi( Blastoconidia), bào tử đớnh bờn (Aleurioconidia),...

+ Hình dạng, kích th−ớc, mầu sắc, bề mặt (nhẵn, gai, gồ ghề).

+ Cách sắp xếp (đơn dộc, chuỗi gốc non (basipetal), chuỗi gốc già (acropetal), khối hình cầu.

- Cơ quan mang bào tử:

+ Nang bào tử: hình dạng, kích th−ớc, mầu sắc, bề mặt của nang, trụ nang, không hoặc có nhánh (nhánh mọc vòng, mọc cách, hợp trục,...) ở nấm tiếp hợp.

+ Cơ quan mang bào tử trần (conidioferous appatus) gồm giá bào tử trần (conidiophore): kích th−ớc (đ−ờng kính, chiều dài), bề mặt (nhẵn, gai, có nốt sần,...), mầu sắc, có vách ngăn hay không, có hay không có cấu trúc dặc

32

biệt nh− tế bào chân (footcell), sợi cứng (setae), tăng tr−ởng ở gốc hay ngọn. Có hoặc không có dạng hình thái đặc biệt bó giá (coremium, synnema ), đệm giá (sporodochium). Các nhánh (nếu có), số l−ợng nhánh, kích th−ớc, bề mặt, mầu sắc, cách sắp xếp (đối xứng, không đối xứng, sát nhau hay tẽ rộng), vị trí nhánh (dọc giá hay ở ngọn giá....).

+ Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell).

Kiểu tế bào sinh bào tử trần (thể bình - phialo), dạng có đốt ở đỉnh (annello), dạng sinh bào tử trần qua lỗ để lại sẹo (poroconidia) hình dạng, kích th−ớc, mầu sắc, cách sắp xếp (đơn độc hoặc thành cụm, vòng), vị trí (trên sợi nấm, dọc theo giá bào tử trần, các nhánh hoặc ở đỉnh giá, đỉnh nhánh)....

- Sợi nấm: Có hoặc không có vách ngăn ngang, đ−ờng kính, mầu sắc bề mặt (nhẵn, gai, có nốt sần...), có hay không có dạng hình thái đặc biệt nh− bó sợi, hạch nấm, đệm nấm (synnema, sclerotia, stroma...).

- Thể quả túi (ascocarp): vị trí, số l−ợng, hình dạng, kích th−ớc, mầu sắc, bề mặt, các phần phụ (nếu có) của thể quả, túi bào tử (ascus) bào tử túi (ascosporum).

2.3.3.3. Tiến hành định loại

Căn cứ vào kết quả khảo sát đầy đủ, chính xác các đặc điểm khuẩn lạc và các đặc điểm vi học, tiến hành xác định tên loài của chủng vi nấm theo các chuyên luận phân loại hiện đang đ−ợc sử dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm phân loại vi nấm.

- Các chuyên luận phân loại đựơc sử dụng trong đề tài là:

+ Barnet W.B. et Barry B. Hunter (1973), “Illustrated genera of Fungi imperfecti”, Mineapolis, Minesota, USA [12].

+ Katsuhiko Ando “Identification of fungi Imperfecti”, 07-2002, NITE [21].

+ Raper B. & Fennell D. (1965) “The genus Aspergillus”, Baltimo Wiliam & Wilkin, USA [25].

33

+ Raper B. & Thom C. (1968), “A manual of Penicillia”, Hafner Publishing company, New York & London [24].

+ O^′Donnell L. (1978), “Zygomycetes in culture”, Department of Botany University of Georgia [23].

+ Hanlin R.T. (1989), “Illustrted genera of Ascomycetes”, St. Paue., Minesota. USA [18].

+ Domsch K.H. & W.Gams et all., 1986 - Compendium of soil fungi.

vol I, II, Academic press, London, New York [14].

+ Ellis W.B., 1976 - More Dematiceous Hyphomycetes , CMI, Kew, England [15].

+ Booth C., 1971 - The genus Fusarium. Kew, England [13].

2.3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi nấm

2.3.4.1. Nghiên cứu khả năng sinh enzym phân huỷ cơ chất gelatin:

Theo ph−ơng pháp của Laster Hankin, S.L. Anagnistakis, 1975 [17]. - Với cơ chất gelatin: Sử dụng môi tr−ờng nutrient agar 0,4% gelatin (W/V). Công thức: Gelatin - 4 g; Nutrient Agar - 20g;N−ớc cất 1000ml.

pH môi tr−ờng: 7,0 ± 0,2

Sau khi pha và hấp vô trùng môi tr−ờng, để nguội đến khoảng 45⁰C phân phối ra các đĩa thạch (25 ml/đĩa). Khi môi tr−ờng đông lại, cấy các chủng vi nấm lên đĩa môi tr−ờng theo ph−ơng pháp cấy điểm và nuôi cấy ở nhiệt độ 25⁰C trong 4 ngày. Dùng thuốc thử HgCl₂ đổ láng trên bề mặt đĩa thạch, đo bán kính khuẩm lạc và bán kính vòng phân giải (vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc). Tính hệ số phân giải theo công thức [7] :

I = R₂²/R₁²

Trong đó: R₂ là bán kính vòng phân giải; R₁ là bán kính kính khuẩn lạc;

Hệ số phân giải I càng lớn thì họat tính enzym càng cao.

2.3.4.2. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phân huỷ cơ chất xenluloza:

Theo ph−ơng pháp thạch bản (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, NXBKH&KT, Hà Nội, 1972) [3].

34

Dùng môi tr−ờng CMC agar, pha theo công thức sau:

Xenluloza -1g; Czapek Dox Agar - 48g; N−ớc cất vừa đủ 1000ml. pH: 7,0 ± 0,2

Nồng độ cơ chất là 0,1%(w/v). Sau khi pha và vô trùng môi tr−ờng, để nguội đến khoảng 45⁰C, phân phối ra đĩa thạch(25ml/đĩa). Khi môi tr−ờng đông lại, cấy các chủng vi nấm lên đĩa môi tr−ờng theo ph−ơng pháp cấy điểm và nuôi cấy ở nhiệt độ 250C trong 4 ngày. Dùng thuốc thử lugol đổ láng trên bề mặt đĩa thạch, đo bán kính khuẩn lạc và bán kính vòng phân giải ( vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc). Tính hệ số phân giải theo công thức đã nêu ở phân trên.

2.3.5. Ph−ơng pháp bảo quản các chủng nấm sợi

Sử dụng ph−ơng pháp bảo quản của D.Smith và cộng sự, 1994 [28]. Gồm 2 ph−ơng pháp sau:

2.3.5.1. Ph−ơng pháp bảo quản trong silicagel

- Cho khoảng 20 hạt silicagel không chỉ thị mầu vào lọ thuỷ tinh 30ml có nút vặn chịu nhiệt, khử trùng khô ở 1800 C trong 3 giờ.

- Sau đó đặt các lọ đã đ−ợc khử trùng vào trong khay đá và để ở tủ lạnh - 200C tr−ớc khi tiến hành bảo quản.

- Các chủng nấm đ−ợc cấy vào đĩa petri trên môi tr−ờng malt agar (hoặc môi tr−ờng phù hợp với từng loại vi nấm) để vi nấm phát triển và sinh bào tử tối đa.

- Cho dung dịch 5% sữa gầy (W/V) vào mỗi đĩa môi tr−ờng có các khuẩn lạc vi nấm, dùng que gạt thuỷ tinh vô trùng gạt đều trên khuẩn lạc vi nấm tạo thành một hỗn dịch đồng nhất.

- Cho 0,3 - 0,5 ml hỗn dịch bào tử vào gel lạnh trộn đều.

- Để các lọ vào tủ làm khô có độ ẩm t−ơng đối 30 - 40%, ở nhiệt độ 250 C từ 10 - 14 ngày.

- Bảo quản ở nhiệt độ 4 - 250 C.

2.3.5.2. Ph−ơng pháp bảo quản các loài nấm sợi trong glyxerin 10% ở nhiệt độ - 20⁰C.

- Các chủng nấm đ−a vào bảo quản đ−ợc cấy chuẩn bị trong đĩa petri trên môi tr−ờng malt agar hoặc trên môi tr−ờng thích hợp với từng chủng loại nấm. Nuôi cấy

35

trong 2 tuần để phát triển tối đa.

- Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch glyxerin 10%, 0,1% DMSO khử trùng −ớt ở 110⁰C.

- Chia đều vào các ống lạnh sâu, mỗi ống 0,5ml dung dịch.

- Dùng ống nhựa cắt thạch có nấm thành các khối thể tích khoảng 2mm³. - Cho 5-7 mẩu thạch có nấm vào mỗi ống lạnh sâu đã có 0,5ml glyxerin 10%. - Để 1 giờ cho các tế bào nấm lấy lại trạng thái bình th−ờng.

- Để lạnh từ 5⁰C đến -20⁰ C/ 24 giờ. Sau đó bảo quản ở nhiệt độ - 20⁰C.

2.3.6. Ph−ơng pháp phục hồi

2.3.6.1. Phục hồi các chủng bảo quản trên silicagel

- Lấy khoảng 5 hạt silicagel chứa bào tử nấm rắc đều lên đĩa môi tr−ờng malt agar và nuôi cấy ở nhiệt độ 20 - 250C trong 2 - 3 ngày (tuỳ từng loài).

- Đánh giá độ phục hồi của các chủng vi nấm: rất tốt, tốt, khá, yếu, không phục hồi.

2.3.6.2. Phục hồi các chủng bảo quản lạnh

- Đặt ống lạnh sâu vào nồi cách thuỷ 37⁰C trong 1 phút để làm tan băng hoàn toàn.

- Lấy 3 miếng thạch từ ống lạnh sâu đặt vào đĩa môi tr−ờng và 1 miếng đặt vào ống thạch nghiêng (môi tr−ờng malt agar) nuôi cấy ở nhiệt độ 20 -25⁰C tuỳ từng loài trong 2 - 3 ngày.

- Đánh giá độ phục hồi của vi nấm theo ph−ơng pháp F.P.Simione, M.S & EM. Brown, B.S.,1991 [26]: ph−ơng pháp này dựa trên mật độ khuẩn lạc mọc trên đĩa petri để tính ra CFU (Bảng 2.1)

Bảng 2. 1: Tiêu chuẩn đánh giá độ phục hồi sau bảo quản

STT Số khuẩn lạc Tiêu chuẩn CFU

1 >100 E (excellent) :rất tốt ∼ 3,33 ì 10⁵ 2 50 - 100 G (good): tốt ∼ 1,69 – 3,33ì 10⁵ 3 10 - 50 F⁺ (Fair Plus): khá ∼3,33 ì10⁴∼1,69ì 10⁵ 4 5 - 10 _{F (fair): trung bình} ∼1,69ì 104∼3,33 ì104 5 <5 _{P (poor): yếu} ∼1,69ì 10⁴ 6 0 Non-living: không sống sót

36

Ch−ơng 3

Kết quả nghiên cứu

3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi nấm từ môi tr−ờng đất khu vực v−ờn Bách Thảo

3.1.1. Thành phần chủng loại một số chi vi nấm trong đất v−ờn Bách Thảo

Chúng tôi đã phân lập từ môi tr−ờng đất v−ờn Bách Thảo đ−ợc 171 chủng gồm 76 loài thuộc 29 chi. Danh sách cụ thể ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Các chủng loài vi nấm phân lập đ−ợc trong môi tr−ờng đất

TT Tên chi ^STT Tên loài Ký hiệu chủng

1 Acremonium furcatum F. And V. Moreau

D123 1 Acremonium

2 Acremonium fusidioides (Nicot) W. Gams D58, D60 3 A. aculeatus Iizuka D07, D103, D106, D113, D114, D116, D118, D127, D142, D145 D146, D50, D51, D64, D02 4 A. asperescens Stolk D90, D96 5 A. awamori Nakazawa D06, D139 6 A. candidus Link D35, D48

7 A. carbonarius (Bainer) Thom D03, D77, D81, D89 8 A. carneus (V.Tiegh) Blochwih D102

9 A. ficuum (Reich.) Hennings D107, D108, D28, D88 10 A. flavipes (Bain. and Sart.)Thom

and Church

D159 2 Aspergillus

11 A. japonicus Saito var. aculeatus

(Iizuka)

37

12 A. japonicus Saito D104, D147

13 A. niger Van Tieghem D04, D05, D117, D63 14 A. niveus Blochwitz D164

15 A. oryzae (Ahlburg) Cohn D126 16 A. parasiticus Speaere D119 17 A. terricola Marchal D130

18 A. ustus (Bain.) Thom and Church D97, D45, D46, D47 19 A. wentii Wehmer D54

3 Botryodiplodia 20 Botryodiplodia sp. D170 4 Chrysosporium 21 Chrysosporium sp. D27

22 C. oxysporum Beerk. dnd Curt., D167 23 C. cldosporioides (Fres.) de Vries D74 5 Cladosporium

24 C. sphaerospermum Penz D171, D31, D150, D98 6 Curvularia 25 Curvularia eragrostidis (P.

Henn.) J.A.Meyer

D153, D161 7 Didymostilbe 26 Didymostilbe sp. D132

8 Eurotium 27 Eurotium rubrum Koning, Spicermann and Bremer

D01

28 F. solani(Mart.)Sacc., Michelia D101, D133, D73 29 F. ventricosum Appel and

Wollenw

D82, D91, D99 9 Fusarium

30 F. xylaryoides Heim and Sacccas D29 10 Geotrichum 31 Geotrichum candidum Link D168

32 G. macrospora Moustafa D111 11 Gilmaniella

33 G. subornata Morinaga D120 34 G. roseum Bain D41 12 Gliocladium

35 G. virens Miller, Giddens and Foster

D105, D79,D62 13 Gloeosporium 36 Gloeosporium sp. D160

14 Hainesia 37 Hainesia sp. D131, D61 15 Hansfordia 38 Hansfordia sp. D70

38

39 H. grisea var. thermoidea Cooney and Emerson

D169, D75 40 H. fuscoatra Traaen D34, D57 41 H. fuscoatra Traaen var.

fuscoatra

D124 42 H. grisea Traaen var. grisea D135, D86 16 Humicola

43 H. insolens Cooney and Emerson D19, D20 17 Mucor 44 Mucor circinelloides van Tiegh

f.circinelloides

D38

18 Nectria 45 Nectria inventa Pethybr D43, D44, D94 19 Nigrospora 46 Nigrospora musae McLennan

and Hoette D112 47 P. biforme Thom D66 48 P. cacei Staub D71 49 P. citrinum Thom D09, D115, D12, D125, D137, D141, D143, D148, D15, D151, D163, D24, D25, D52, D67, D76, D78, D80, D83, D85, D87 50 P. duclauxi Decacroix D32, D53, D84 51 P. frequentans Westling D140 52 P. funiculosum Thom D95 53 P. italicum Wehmer D100 54 P. lanoso- coeruleum Thom D59 55 P. lanosum Wetling D13, D08 56 P. lilacinum Thom D165 57 P. lividum Westling D65 58 P. melinii Thom D109 59 P. nigrican (Bainier) Thom D11 60 P. oxalicum Currie and Thom D138 20 Penicillium

39

62 P. roqueforti Thom D22, D49 63 P. steckii Zaleski D10

64 P. stoloniferum Thom D149, D55 21 Pestalotiopsis 65 Pestalotiopsis sp. D42,D152, D56 22 Scolecobasidium 66 Scolecobasidium tshawytschae

(Doty and Slater)

D37

67 S. brevicaulis (Sacc.) Bainier D110, D121, D134, D14, D18, D40

23 Scopulariopsis

68 S. chartarum(G.Sm.)Morton and G.Sm

D30, D33, D162, D68, D72

24 Thermomyces 69 Thermomyces ibadanensis Apinis and Eggins

D129

25 Thysanophora 70 Thysanophora sp. D144, D154,D155, D156, D157

26 Torula 71 Torula ellisii Yadav and Lal D36 27 Torulomyces 72 Torulomyces sp. D166

73 T. harzianum Rifai D26, D39, D69, D21 74 T. koningii Oudem D23, D92, D93 28 Trichoderma

75 T.hamatum (Bonord.) Bain. D136, D158 29 Veronaea 76 Veronaea coprophila (Subram. Et

Lodha) M.B.Ellis

D122

Nhận xét:

- Đó phân lập, phõn loại từ mụi trường đất vườn Bỏch Thảo cú các chủng vi nấm thuộc các lớp nấm bất toàn (Aspergillus, Penicillium,

Humicola,…), nấm túi (Eurotium), nấm tiếp hợp (Mucor).

- ở môi tr−ờng đất vườn Bỏch Thảo, chi Penicillium cú 18 loài chiếm 23,68%, chi Aspergillus cú 17 loài chiếm 22,36%, chi Humicola cú 05 loài chiếm 6,57%.

40

- Chi Gloeosporium, Hansfordia, Botryodiplodia, Chrysosporium, Geotrichum, Mucor, Didymostilbe, Eurotium, Nigrospora, Scolecobasidium, Thermomyces, Torula, Torulomyces, Veronaea là cỏc chi chiếm tỷ lệ thấp, mỗi chi chỳng tụi chỉ phõn lập được một chủng.

Tính đa dạng của các chi vi nấm phân lập đ−ợc ở mẫu đất v−ờn Bách Thảo được minh họa ở biểu đồ sau (Biểu đồ 3.1).

Acremonium 2 Aspergillus 17 Botryodiplodia 1 Chrys osporium 1 Cladosporium 3 Curvularia 1 Didymos tilbe1 Eurotium 1 Fusarium 3 Geotrichum 1 Gilmaniella 2 Gliocladium 2 Gloeosporium 1 Hainesia 1 Hansfordia 1 Humicola 5 Mucor 1 Nectria 1 Nigrospora 1 Penicillium 18 Pes talotiops is 1 Scolecobasidium 1 Scopulariopsis 2 Thermomycetes 1 Thysanophora 1 Torula 1 Torulomyces 1 Trichoderma 3 Veronaea

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ biểu diễn tính đa dạng của các chi vi nấmtrong đất vườn Bỏch Thảo

3.1.2. Đặc điểm phân loại hình thái của một số loài đại diện các chi vi nấm phân lập đ−ợc

- Chi Acremonium (chủng D123)

Đặc điểm phân loại: Giá bào tử trần không có hoặc ngắn, không hoặc ít phân nhánh, có vách ngang. Tế bào sinh bào tử trần nhỏ dần từ phần gốc đến ngọn và kết thúc bởi một đỉnh. Bào tử trần thuộc típ bào tử ngọn thể bỡnh (phialoconidi), hình dạng biến thiên, không ngăn vách, không màu hoặc màu

41

nâu, và đ−ợc tạo thành ở đỉnh tế bào sinh bào tử trần, thành chuỗi hoặc tụ họp thành khối cầu.

Hỡnh 3.1: Ảnh minh hoạ chi Acremonium (chủng D123);

(A) cơ quan sinh bào tử trần ( x 1000); (B) bào tử trần (SEM x 10000).

- Chi Aspergillus (chủng D07)

Đặc điểm phân loại: Khuẩn lạc th−ờng phát triển nhanh, màu trắng, vàng, nâu vàng, nâu tới đen hoặc màu lục, hầu hết tạo thành lớp dày do sự tạo thành của cơ quan sinh bào tử trần. Cuống đơn độc không phân nhánh, với đỉnh phồng tạo thành bọng (vesicle). Thể bình sinh trực tiếp từ bọng (1 tầng thể bình) hoặc từ các cuống thể bình (2 tầng thể bình). Bọng, thể bình, cuống thể bình (nếu có) tạo thành cơ quan sinh bào tử trần. Bào tử trần nhẵn hoặc gai ráp, không ngăn ngăn vách, không màu hoặc có màu tạo thành chuỗi khô hình cột chặt hoặc tẽ. Một số loài có thể sinh các tế bào Hỹll (Hỹll cells) hoặc hạch nấm.

Hỡnh 3.2: Ảnh minh hoạ chi Aspergillus (chủng D07); (A) cơ quan sinh bào tử trần (x 1000); (B) cơ quan sinh bào tử trần và bào tử trần (SEM x 3500).

- Chi Botryodiplodia (chủng D170)

Đặc điểm phân loại: Khuẩn lạc sinh tr−ởng nhanh, hệ sợi nấm khí sinh A

B A

42

màu nâu đen. Túi bào tử đ−ợc sinh ra từ các đẹm nấm, màu nâu đen, hình gần cầu. Tế bào sinh bào tử trần hình trụ, xen kẽ với các sợi nấm sinh d−ỡng. Bào tử lúc đầu th−ờng không màu, không ngăn vách, hình elip; sau thời gian dài khi già th−ờng có một vách ngăn ngang và chuyển thành màu nâu đen.

Hỡnh 3.3: Ảnh minh hoạ chi Botryodiplodia (chủng D170);

(A) cơ quan sinh bào tử trần ( x 1000); (B) bào tử trần ( x 1000).

- Chi Chrysosporium(chủng D27)

Đặc điểm phân loại: Cơ quan sinh bào tử trần không hoặc ít phân hóa hình thái, không màu hoặc màu nhạt, phân nhánh không đều. Bào tử trần thuộc típ bào tử đớnh bờn (aleurioconidi) và bào tử chia đốt (arthroconidi).

Aleurioconidi đ−ợc tạo thành th−ờng xuyên ở các loài, hình gần cầu, quả lê hoặc gần chùy với vết sẹo ở gốc, không ngăn vách, không màu hoặc nâu nhạt, tạo thành ở đỉnh giá bào tử trần. Các nhánh của giá hoặc của sợi nấm đơn độc rời