Ph−ơng pháp làm đình chỉ trao đổi chất trong bảo quản th−ờng bao gồm việc làm giảm hoạt độ n−ớc trong tế bào bằng cách khử n−ớc hoặc làm lạnh, làm cho quá trình sống gần nh− bị ngừng lại.
23
Nhiệt độ của vi sinh vật đóng băng phải đ−ợc giảm xuống d−ới -700C để làm giảm hoạt động trao đổi chất nh−ng để tất cả các phản ứng lý hoá không xảy ra thì ở một nhiệt độ là -1390C. Nhiệt độ này có thể đạt đ−ợc trong các máy lạnh có khả năng làm hạ nhiệt độ tới -1500C hoặc trong nitơ lỏng.
* Bảo quản lạnh sâu:
Hạ nhiệt độ của các vật liệu sinh vật làm giảm tỷ lệ trao đổi chất cho đến khi tất cả n−ớc nội bào đều bị đóng băng, không một phản ứng sinh hoá nào nữa xuất hiện và trao đổi chất bị ngừng lại. L−u ý rằng một l−ợng nhỏ các hoạt động trao đổi chất có thể diễn ra ở nhiệt độ d−ới-700C và xuất hiện sự kết tinh của n−ớc đá ở nhiệt độ trên -1390C có thể làm nguy hại cho các chủng nấm đ−ợc bảo quản. Do đó, bảo quản vi sinh vật ở nhiệt độ siêu lạnh (-1900C tới -1960C) trong nitơ lỏng là ph−ơng pháp bảo quản tốt nhất hiện nay.
* Ph−ơng pháp:
Chuẩn bị dịch treo tế bào nấm trong glyxerin 10% (v/v) vô khuẩn và cho một l−ợng 0,5ml vào trong một ống dung tích 2ml bằng thuỷ tinh (Boro silicate) hay ống lạnh sâu (polypropylene) đ−ợc dán nhãn có ghi số hiệu của chủng bảo quản.
Đặt ngập những ống thuỷ tinh đã đ−ợc hàn kín miệng trong một bồn chứa erythrocin B để kiểm tra xem chúng kín ch−a. Cần một khoảng thời gian tối thiểu là 1 giờ (đối với cả ống thuỷ tinh hay ống nhựa) để cho các tế bào nấm cân bằng trong glyxerin.
Làm lạnh các ống với tốc độ thích hợp trong máy làm lạnh KRYO 10/16 series II (Planer Products Ltd). Tốc độ làm lạnh yêu cầu phù hợp với từng loài vi sinh vật. Tốc độ -10C/1phút phù hợp với hầu hết các vi nấm thông th−ờng sống sót nh−ng không mang đến sự phục hồi tối −u cho tất cả chúng. Tốc độ làm lạnh đ−ợc kiểm soát nghiêm ngặt trong giai đoạn là từ +50C xuống tới nhiệt độ -500C. Tốc độ làm lạnh từ lúc ban đầu tới 50C không cần quá nghiêm ngặt và ở IMI th−ờng vào khoảng -100C/phút.
24
Khi dịch treo đông lạnh tới nhiệt độ -500C, chuyển chúng vào trong bình chứa nitrogen lỏng là nơi quá trình làm lạnh tới nhiệt độ bảo quản cuối cùng đ−ợc hoàn thành cả đối với pha lỏng và pha hơi.
Làm tan băng một ống đông lạnh sau 4 ngày bằng cách đặt trong một bồn n−ớc l−u chuyển có nhiệt độ khoảng +370C hay trong buồng của máy KRYO 10/16 sử dụng ch−ơng trình tan băng thích hợp. Trong cả hai cách, lấy ống đông lạnh ra ngay sau khi miếng băng cuối cùng tan ra, không đ−ợc để cho dịch tăng tới nhiệt độ của bồn n−ớc hay nhiệt độ của buồng làm tan băng.
Mở ampul bằng cách bẻ đầu ống ra (chú ý thật an toàn) hoặc vặn nút ống nhựa lạnh sâu (cryotube), lấy ra một ít hỗn dịch cấy lên môi tr−ờng nuôi cấy thích hợp.
Những ph−ơng pháp t−ơng tự đã đ−ợc sử dụng đối với các bảo tàng giống khác, nh− ở ATCC đã bảo quản lạnh trong nitơ lỏng đ−ợc sử dụng từ năm 1965 và đem lại kết quả tốt.
* Ưu điểm của việc bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng
+ Hầu hết các nấm sinh và không sinh bào tử đều sống sót tốt, là một ph−ơng pháp có tỷ lệ thành công lớn đã đ−ợc sử dụng.
+ Trao đổi chất gần nh− bị ngừng nếu nhiệt độ bảo quản đ−ợc giữ d−ới -1300C.
* Nh−ợc điểm của bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng
+ Bộ dụng cụ kỹ thuật đắt.
+ Nitơ rất đắt, chỉ áp dụng ph−ơng pháp này khi có một số l−ợng lớn hoặc có sẵn trong kho.
+ Thời tiết nóng hơn thì tốc độ bay hơi của nitơ lỏng có thể nhanh hơn. ứng dụng:
Những loài nấm khó hay không mọc trên môi tr−ờng có thể đ−ợc bảo quản bằng ph−ơng pháp này. Nấm gỉ sắt và nấm than (Loegering, 1965; Kilpatrick và CS, 1971), loài Sclerospora (Gale và CS, 1975; Long và CS,
25
1978) đã đ−ợc bảo quản thành công bằng kỹ thuật bảo quản lạnh trong nitơ lỏng. 9 chủng của loài Sclerospora và một chủng của Bremia lactucae đ−ợc bảo quản tại IMI là các loài gây bệnh trên mô vật chủ và vẫn giữ đ−ợc khả năng gây bệnh sau 1 năm bảo quản. Các nấm gây bệnh trên thực vật sống sót và vẫn giữ đ−ợc khả năng gây nhiễm của chúng. Bảo quản trong ống đông lạnh trong từng ngăn một cho phép dễ dàng tìm đ−ợc các vi sinh vật cần thiết.
Chú ý: Tan băng nhanh mang lại khả năng phục hồi tốt nhất cho các tế bào. Tan băng nhanh tránh đ−ợc kết tinh của đá (điều có thể gây các biến đổi nguy hiểm về cơ học). Morris và CS (1988) cho thấy hồi phục tối −u
Penicilium đ−ợc thấy khi làm ấm ở tốc độ khoảng +2000C/phút. Tốc độ làm ấm này có thể tiến hành trong bồn n−ớc ấm +370C hoặc trong một ch−ơng trình làm lạnh sử dụng phần ch−ơng trình tan băng [28].
