Quan sát các triệu chứng của lợn mắc bệnh, tiến hành mổ khám, lấy mẫu ruột, gan, lách, phổi, hạch rồi ngâm trong formol 10% ựể làm tiêu bản vi thể và bảo quản ở 4oC.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo qui trình tẩm ựúc bằng paraffin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) của phòng thắ nghiệm bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y - trường đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Qui trình làm tiêu bản: Các bước tiến hành
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa formol 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc ựựng hóa chất, phiến kắnh, máy ựúc block, khuôn ựúc, tủ ấm 37ỨC, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 - 52ỨC, xylen, paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin, EosinẦ
- Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, láchẦ - Cố ựịnh bệnh phẩm (mục ựắch ựể giết chết tổ chức).
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý thể tắch formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vùi bệnh phẩm (tạo ra các chất nền cho tổ chức dễ cắt).
+ Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 - 5mm rồi xâu thành một dây sao cho các miếng bệnh phẩm cách nhau 0,5cm. Trên ựầu dây có gắn một mẩu giấy ghi tên bệnh phẩm. Sau ựó ựem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn
Cồn I: 3 giờ
Cồn II: 3 giờ
Cồn III: 3 giờ
Cồn IV: 12 giờ
Mục ựắch ựể khử nước ra khỏi tổ chức. + Khử cồn: Cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen Xylen I: 3 giờ
Xylen II: 3 giờ Xylen III: 4 giờ
Mục ựắch ựể khử hết cồn ra khỏi tổ chức.
Yêu cầu: Khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là ựược. Nếu ựể quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
+ Khử xylen: Cho qua hệ thống paraffin ựã ổn ựịnh (paraffin có từ 3 - 5% sáp ong ựã nấu, ựảo nhiều lần thành môi trường ựồng nhất ổn ựịnh, ựặc chắc, không lẫn tạp chất, không bọt) gồm 3 lọ.
Parafin I: 12 giờ trong tủ ấm 56ỨC Parafin II: 3 giờ trong tủ ấm 56ỨC Parafin III: 4 giờ trong tủ ấm 56ỨC
Mục ựắch ựể khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm ựều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt ựộ trên 56ỨC thì miếng tổ chức sẽ giòn và dễ vỡ, khó cắt.
- đúc block
+ Mục ựắch: đưa bệnh phẩm vào trong khối parafin tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: Máy ựúc block, parafin. + Phương pháp tiến hành:
đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chắnh giữa khuôn block, ựổ nhanh parafin lỏng vào khuôn block. Sau ựó, ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội ựến khi block ựông cứng, ựặc chắc là ựược.
- Cắt tãi mảnh:
+ Chuẩn bị: Máy cắt, dao cắt, nước ấm 48ỨC - 52ỨC, phiến kắnh, pank kẹp... + Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với ựộ dày khoảng 3 - 5ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt ựều, lấy phiến kắnh hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48ỨC - 52ỨC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể ở tủ ấm 37ỨC ựến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin.
- Nhuộm tiêu bản: Bao gồm các bước sau:
Xylen I: 5 - 10 phút Xylen II: 5 - 10 phút Xylen III: 5 - 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc
Cồn 100ỨC: 5 - 10 phút
Cồn 95ỨC: 5 - 10 phút Cồn 80ỨC: 5 - 10 phút Cồn 60ỨC: 5 - 10 phút
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 5 - 10 phút
+ Nhuộm hematoxylin (nhuộm nhân): Lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản. để trong khoảng 5 - 10 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa sạch qua nước. Lau sạch nước quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu ựậm nhúng qua lọ cồn axit (cồn 96ỨC + HCl 1%) trong 30 giây. + Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 - 10 phút, tùy theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 5 - 10 phút cho hết Eosin thừa.
+ Tẩy nước: Cho tiêu bản hai lọ cồn tuyệt ựối, mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua hệ thống xylen I, xylen II sau ựó cho vào xylen ựã làm nóng trong tủ ấm 37ỨC trong vòng 2 phút.
Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
+ đánh giá kết quả:
đem soi lên kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10. Nếu thấy màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
