Chương 2: THỰC NGHIỆM
2.4.3Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96 well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), MCKane, L., và Kandel (1996).
Quy trình thử nghiệm
∗ Chuẩn bị mẫu: Các chất kháng sinh và mẫu cao thửđược pha trong dung môi DMSO ở các nồng độ: Ampiciline 50 mM cho vi khuẩn Gr (+), Tetracycline 10 mM cho vi khuẩn Gr (-), Nystatin hoặc Amphotericin B 0,04 mM cho nấm sợi và nấm men. Mẫu thử có nồng độ 4 mg/mL.
Các vi sinh vật hoạt hoá và pha loãng trong môi trường tương ứng với nồng độ
0,5 đơn vị McFland (1,5 x 108 CFU/mL).
∗ Đo mẫu: Lần lượt cho các mẫu chứng, mẫu cao thí nghiệm và dung dịch môi trường chứa vi sinh vật vào các giếng trên phiến 96 giếng theo các dãy sau:
9 Dãy chứng dương tính: 10 μL mẫu kháng sinh + 190 μL dung dịch môi trường chứa vi sinh vật.
9 Dãy chứng âm tính: 10 μL DMSO 10 % + 190 μL dung dịch môi trường chứa vi sinh vật.
9 Dãy thí nghiệm: 10 μL mẫu cao thí nghiệm + 190 μL dung dịch môi trường chứa vi sinh vật.
Chú ý: Nồng độ DMSO trong các giếng thử nghiệm không vượt quá 0,5 %.
Các kết quả được đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm ở 37 0C trong 24 giờ cho thí nghiệm với các vi khuẩn và 30 0C trong 48 giờ cho nấm sợi và nấm men.
Kết quả dương tính được ghi nhận tại các nồng độ mà ởđó không có vi sinh vật phát triển nghĩa là tại nồng độ này trên môi trường nuôi cấy đĩa thạch sốđơn vị lạc khuẩn (CFU) < 5.
Nồng độ thấp nhất tương ứng với kết quả dương tính là nồng độức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration, MIC). Mẫu thử có MIC ≤ 200 μg/mL đối với cao thô hay MIC ≤ 50 μg/mL đối với mẫu tinh khiết thì được xem là dương tính kháng vi sinh vật.