Chương 2: THỰC NGHIỆM
2.4.2.Hoạt tính gây độc tế bào
Theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990), Likhiwotayawuid và cộng sự
(1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Hoa Kỳ
(NCI).
Quy trình thử nghiệm
∗ Chuẩn bị mẫu:
- Chứng âm là dung môi DMSO 10 %.
- Chứng dương tính là Ellipticine trong DMSO
- Mẫu cao thử nghiệm với nồng độ 4 mg/mL trong DMSO. - Mật độ tế bào là 3 - 4 x 104/giếng.
- Dung dịch SRB (sulforhodamine B):
∗ Đo mẫu: Cho các mẫu cao thử nghiệm và dung dịch tế bào vào phiến 96 giếng theo thứ tự.
9 Dãy chứng âm tính: 10 μL DMSO 10 % + 190 μL dung dịch tế bào
9 Dãy chứng dương tính: 10μL dung dịch Ellipticine + 190 μL dung dịch tế
bào
9 Dãy mẫu cao thử: 10 μL mẫu + 190 μL dung dịch tế bào.
9 Dãy mẫu ngày zero: 200 μL dung dịch tế bào
Chú ý: Nồng độ DMSO trong các giếng không vượt quá 0.5 %.
Các mẫu cao thử nghiệm và mẫu chứng được ủ trong 72 giờ ở 37 0C, độẩm là 98 % trong môi trường 5 % CO2. Còn mẫu ngày zero được ủ trong 10 phút cùng
điều kiện.
Sau khi ủ, loại bỏ dung dịch môi trường cũ ở các mẫu và cho vào 200 μL TCA 10 % (Trichloroacetic acid), ủ tiếp trong 30 phút ở 4 0C.
Rửa bỏ TCA với nước và để khô phiến giếng ở nhiệt độ phòng.
Tiếp theo, nhuộm tế bào bằng 100 μL dung dịch SRB (sulforhodamine B) trong 30 phút.
Sau đó loại bỏ dung dịch SRB, dùng acid acetic 1 % rửa các tế bào nhiều lần, để
phút. Đọc mật độ quang ở bước sóng 515 nm bằng máy Elisa.
Đánh giá khả năng sống sót của tế bào (CS – Cell survival): Khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ khảo sát của mẫu thử tính theo phần trăm so với các mẫu đối chứng (Công thức 2.4). σ ± ⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎢ ⎣ ⎡ × − − = 100 % NgàyO Âm NgàyO TN OD OD OD OD CS
Trong đó: ODÂm, ODNgàyO và ODTN là độ hấp thu của mẫu chứng âm, mẫu ngày zero và mẫu cao thử.
Độ lệch chuẩn σ tính theo công thức (2.2).
Các mẫu thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của tế bào với CS % ≤ 50 thì
được chọn tiếp để tiếp tục khảo sát nồng độ mà tại đó mẫu thử có khả năng gây độc hay ức chế 50 % tế bào (IC50, μg/mL).
Các giá trị IC50 được xác định theo cách sau: Đo và tính các giá trị CS % tương
ứng với các nồng độ. Dựa vào các giá trị CS % trên để xây dựng đồ thị biểu diễn sự
tương quan giữa nghịch đảo nồng độ mẫu thử với logarit neper của giá trị CS % (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
theo phương trình 2.3.
Từđồ thị xác định IC50, là nồng độ tương ứng với 50 % tế bào sống sót.