Pha chế dung dịch chuẩn PAR, CPM và hỗn hợp của chỳng.
Tiến hành đo phổ hấp thụ phõn tử của PAR, CPM trong vựng bước súng khảo sỏt , ghi cỏc dữ liệu và sử dụng chương trỡnh lọc Kalman để tớnh toỏn hàm lượng của PAR, CPM trong hụ̃n hợp tự pha và trong cỏc mõ̃u thuụ́c.
2.3. Đỏnh giỏ độ tin cậy của quy trình phõn tớch 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiờn cứu mà hệ thống phõn tớch cho tớn hiệu phỏt hiện phõn biệt với tớn hiệu nền . Trong phõn tớch trắc quang LOD tớnh theo phương trỡnh hồi quy có cụng thức như sau:
y
3.S LOD =
B (2.1)
Trong đú:
Sy: là độ lệch chuẩn của tớn hiệu y trờn đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chớnh là độ nhạy của phương phỏp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiờn cứu mà hệ thống phõn tớch định lượng được với tớn hiệu phõn tớch khỏc, cú ý nghĩa định lượng với tớn hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95% và thường người ta sử dụng cụng thức:
10.Sy LOQ =
B (2.2)
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Đỏnh giỏ độ đỳng của phương phỏp đối với cỏc hụ̃n hợp PAR và CPM tự pha chế thụng qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của cỏc phộp phõn tớch đối
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
với mẫu chuẩn tự pha chế thụng qua việc tớnh tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tớnh toỏn được với nồng độ thực đó biết của mẫu theo cụng thức:
Tinh toan 0 0
C - C
RE% = .100%
C (2.3)
Trong đú: RE% là sai số tương đối của phộp xỏc định nồng độ cỏc cấu tử.
CTinh toan (àg/mL) là nồng độ tớnh toỏn được từ chương trỡnh lọc Kalman.
C 0 (àg/mL) là nồng độ đã biờ́t của dung dịch PAR, CPM trong hỗn hợp. - Đỏnh giỏ độ đỳng của phương phỏp đối với cỏc mẫu thuụ́c nghiờn cứu thụng qua độ thu hồi bằng phương pháp thờm chuẩn . Độ thu hồi (Rev) được tớnh theo cụng thức sau:
C - T Re = .100% a a C v (2.4)
Trong đú: CT: nồng độ (àg/mL) của dung dịch PAR hoặc CPM xỏc định được trong mẫu sau khi thờm chuẩn;
Ca: nồng độ (àg/mL) của dung dịch PAR hoặc CPM xỏc định được trong mẫu khi chưa thờm chuõ̉n.
a: nồng độ (àg/mL) của dung dịch chuẩn PAR hoặc CPM thờm vào mẫu (đó biết). - Độ lặp lại của phương phỏp được đỏnh giỏ thụng qua độ lệch chuẩn (S) hoặc đụ̣ lợ̀ch chuõ̉n tương đụ́i (RSD).
n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C (2.5) RSD = .100(%) C S (2.6) Trong đú: Ci là các giá trị nồng độ (àg/mL) của dung dịch PAR hoặc CPM tớnh được lần thứ i;
là giỏ trị nồng độ thực của mẫu;
C là giỏ trị nồng độ trung bỡnh tớnh được sau n lần xỏc định; k là số bậc tự do.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.4. Đánh giá kết quả phộp phõn tớch theo thống kờ
Khoảng tin cậy của phộp xỏc định nồng độ được tớnh theo cụng thức:
P,k
t .S X ± ε = X ±
n (2.7)
Với tP, k là hệ số phõn bố chuẩn Student ứng với xỏc suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 5 = 2,57 ); X là giỏ trị trung bỡnh của tập số liợ̀u các kờ́t quả nghiờn cứu; S là độ lệch chuẩn, được tớnh theo cụng thức (2.5); n là số phộp đo.
2.4. Thiết bị , dụng cụ và hoỏ chất
2.4.1. Thiết bị
- Mỏy đo phổ UV-VIS Spectrophotometer UV-1700-SHIMADZU (Nhật Bản) cú khả năng quột phổ trong khoảng bước súng 190 - 1100 nm, cú kết nối mỏy tớnh.
- Bộ cuvột thạch anh.
- Cõn điện tử cú độ chớnh xỏc đạt 0,1mg; Mỏy đo pH; Bếp cỏch thuỷ; Mỏy cất nước.
2.4.2. Dụng cụ
- Cỏc dụng cụ thủy tinh cần thiết như: bỡnh định mức, pipet, phễu, lọ đựng húa chất, ống nghiệm, cốc thuỷ tinh...
- Chương trỡnh lọc Kalman tớnh toỏn đồng thời nồng độ cỏc cấu tử [9, 20]. - Một số dụng cụ khỏc.
2.4.3. Húa chất
Chất chuẩn paracetamol và clopheninamin maleat đạt tiờu chuẩn dược dụng Việt Nam do Viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
Cỏc húa chất: HCl, H2SO4, HNO3, CH3COOH, NaOH, KH2PO4, Na2HPO4., CH3COONa, Na2B4O7, NH4Cl ... dựng để pha chế cỏc dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
Nguyờn liệu phõn tớch:
- Thuốc viờn nộn Detazofol do Cụng ty cổ phần dược phẩm Hà Nội sản xuất. - Thuốc viờn nộn Slocol do Cụng ty cổ phần dược phẩm Hậu Giang sản xuất.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thuốc viờn nộn Pamin do Cụng ty cổ phần dược phẩm Hậu Giang sản xuất. - Thuốc viờn nang Pacemin do Cụng ty cổ phần dược phẩm Hà Tõy sản xuất.
Chuẩn bị các dung dịch.
- Dung dịch HCl 0,1M, 0,01M, 0,001M - Dung dịch H2SO4 0,05M, 0,005M, 0,0005M - Dung dịch HNO3 0,1M, 0,01M, 0,001M
Cỏch pha chế cỏc dung dịch trờn:
Lấy 41,8 mL dung dịch HCl 37% (d = 1,18) đem pha loãng bằng nước cṍt 2 lõ̀n và định mức thành 500mL thu được dung dịch HCl 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HCl 0,1M; 0,01M và 0,001M.
Lấy 2,7 mL dung dịch H2SO4 98% (d = 1,84) đem pha loãng bằng nước cṍt 2 lõ̀n và định mức thành 50mL thu được dung dịch H2SO4 1M (pH = 0). Sau đó pha thành H2SO4 0,05M; 0,005M và 0,0005M.
Lấy 3,5 mL dung dịch HNO3 65% (d = 1,39) đem pha loãng bằng nước cṍt 2 lõ̀n và định mức thành 50mL thu được dung dịch HNO3 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HNO3 0,1M; 0,01M và 0,001M.
Cỏc dung dịch này đều được xỏc định lại nồng độ bằng phương phỏp chuẩn độ.
- Pha dung dịch đệm axetat
pH= 4: bằng cỏch lấy 50 mL dung dịch NaOH 1M cho vào bỡnh định mức 500 mL, sau đú thờm 285 mL dung dịch axit CH3COOH 1M rồi định mức đến 500 mL.
pH = 5: thỡ lấy 70 mL muối CH3COONa 0,2M trộn với 30 mL CH3COOH 0,2M rồi định mức thành 500 mL.
pH = 6: Trộn 50 mL dung dịch NaOH 1M với 52,3mL dung dịch CH3COOH 1M sau đú định mức thành 500 mL bằng nước cất.
- Pha đệm photphat
pH = 7: Cõn chớnh xỏc 7,2650 g Na2HPO4.12H2O và 3,5220 g KH2PO4 cho vào bỡnh định mức 1 lớt, hũa tan lắc đều rồi định mức đến vạch.
- Pha đệm Borat
pH = 8: Lấy 140 mL Na2B4O7 0,2M sau đú định mức thành 250 mL bằng dung dịch HCl 0,1M.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
pH= 9: Hũa tan 3,0920g H3BO3, 0,8530g NaOH và 3,7280g KCl trong 500 mL nước cṍt, lắc cho tan hoàn toàn, để nguội và định mức thành 1 lớt.
pH=10: Hũa tan 3,0920g H3BO3, 1,7560g NaOH và 3,7280g KCl trong 500 mL nước cṍt, lắc cho tan hoàn toàn, để nguội và định mức thành 1 lớt.
pH=11: Hũa tan 6,2090g H3BO3, 4,0000g NaOH và 3,7000g KCl trong 500 mL nước cṍt, lắc cho tan hoàn toàn, để nguội và định mức thành 1 lớt.
Cỏc dung dịch đệm sau khi pha đều được kiểm tra và điều chỉnh bằng mỏy đo pH.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn PAR và CPM
Cõn chớnh xỏc một lượng 0,0125g PAR, CPM hũa tan hoàn toàn và định mức thành 25 mL được dung dịch cú nồng độ 500 àg/mL. Từ dung dịch gụ́c có nụ̀ng đụ̣ 500 àg/mL tiờ́n hành pha các dung dịch có nụ̀ng đụ̣ cõ̀n thiờ́t cho các phép đo quang. Dung dịch được pha chờ́ hàng ngày trước khi đo quang.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sỏt sơ bộ phổ hấp thụ phõn tử của paracetamol và clopheninamin maleat
Đờ̉ quá trình đo đụ̣ hṍp thụ quang của dung dịch ụ̉n định trước hờ́t chúng t ụi tiờ́n hành k hảo sỏt phổ hấp thụ phõn tử và xỏc định khoảng bước súng cực đại của PAR,CPM [ 6, 7, 13, 17].
Pha dung dịch PAR,CPM và tiến hành quột phổ của cỏc dung dịch đú trong khoảng bước súng từ 200 đến 900 nm. Kờ́t quả đo đụ̣ hṍp thụ quang trong khoảng bước súng từ 210 ữ 300 nm được thờ̉ hiợ̀n ở hình 3.1
Hỡnh 3.1. Phụ̉ hṍp thụ của dung dịch chuõ̉n PAR (1) và CPM (2)
Nhọ̃n xét: Kết quả khảo sỏt cho thấy phụ̉ hṍp thụ của PAR và CPM xen phủ nhau gần như hoàn toàn, do đó khụng thờ̉ xác định được đụ̀ng thời PAR và CPM trong mụ̣t hụ̃n hợp theo phương phỏp trắc quang thụng thường. Muụ́n xác định được chỳng bằng phương pháp trắc quang cõ̀n phải tách chúng ra khỏi nhau . Tuy nhiờn viợ̀c tách chỳng ra khỏi nhau là rṍt tụ́n kém và mṍt nhiờ̀u thời gian. Chớnh vỡ vậy mục tiờu của luọ̃n văn là nghiờn cứu cách xác định PAR và CPM khi chúng cùng có mặt trong hụ̃n hợp mà khụng phải tỏch ra khỏi nhau.
PAR cú độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 244 nm cũn CPM cú độ hấp thụ quang cực đại tại bước súng λ = 264 nm. Trờn cơ sở khảo sát trong khoảng bước súng từ 300-900 nm, PAR và CPM gần như khụng hấp thụ ỏnh sỏng, do đú chỳng tụi lựa chọn bước sóng tối ưu để thực hiện c ỏc phộp đo độ hấp thụ quang của dung dịch PAR và CPM trong khoảng từ 210-300 nm cho việc tiờ́n hành các nghiờn cứu tiờ́p theo. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 210 216 222 228 234 240 246 252 258 264 270 276 282 288 294 300 (1) (2) ABS ) (nm
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. Khảo sỏt sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PAR và CPM vào pH
Pha 2 dóy dung dịch gụ̀m 17 mõ̃u PAR cú nồng độ 8 àg/mL và 17 mõ̃u CPM cú nụ̀ng đụ̣ 15 àg/mL trong các mụi trường HCl, H2SO4, HNO3 cú pH =1, pH =2, pH =3, dung dịch đệm axetat (pH =4, pH =5, pH=6), dung dịch đệm photphat (pH =7), dung dịch đệm borat (pH =8, pH =9, pH =10, pH =11). Đo đụ̣ hấp thụ quang của cỏc dung dịch ở bước súng 210-300 nm ở cỏc mụi trường khỏc nhau tại thời điờ̉m 30 phỳt sau khi pha và ở nhiệt độ 250C. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 là kết quả độ hấp thụ quang ở bước súng cực đại của PAR là 244nm và CPM là 264 nm trong cỏc dung mụi khỏc nhau với các giá trị pH tại thời điờ̉m 30 phỳt sau khi pha và ở nhiệt độ 250C. Cỏc giỏ trị ghi trong bảng là giỏ trị trung bình của 5 lõ̀n đo.
Bảng 3.1. Độ hấp thụ quang của PAR và CPM ở các giá trị pH
Mụi trƣờng HCl HNO3 H2SO4
MẪU 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Abs PAR 0,532 0,530 0,479 0,508 0,520 0,474 0,526 0,515 0,483 CPM 0,302 0,315 0,273 0,300 0,249 0,218 0,330 0,328 0,296
Mụi trƣờng Đệm axetat Đệm photphat Đệm borat
MẪU 10 11 12 13 14 15 16 17
pH 4 5 6 7 8 9 10 11
Abs PAR 0,524 0,480 0,499 0,500 0,508 0,502 0,480 0,500
CPM 0,288 0,298 0,212 0,287 Khụng ổn định
Nhọ̃n xét: Từ kờ́t quả khảo sát ở bảng 3.1, chỳng tụi nhận thṍy đụ́i với dung dịch CPM, đụ̣ hṍp t hụ quang đo được là khụng ổ n định trong mụi trường baz ơ và mụi trường axit HNO 3, trong mụi trường trung tính và mụi trường axit HCl , axit H2SO4 cho kờ́t quả đo đụ̣ hṍp thụ quang là ổn định. Cũn với PAR, đụ̣ hấp thụ quang ổn định và khụng thay đổi trong mụi trường axit và trung tớnh. Kờ́t quả nghiờn cứu sơ bụ̣ cho thṍy khoảng tuyờ́n tính , cũng như độ hấp thụ quang của PAR và CPM đạt cực đại trong mụi trường axit HCl 0,1M. Do đó , chỳng tụi chọn mụi trường để nghiờn cứu thuận lợi cho cả PAR và CPM là dung dịch HCl 0,1M.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3. Khảo sỏt sự phụ thuụ̣c độ hấp thụ quang của PAR và CPM theo thời gian
Pha dung dịch PAR cú nồng độ 8 g/mL và dung dịch CPM cú nồng độ 15g/mL trong dung mụi HCl 0,1M, đo đụ̣ hṍp thụ quang của cỏc dung dịch ở bước súng 210-300 nm tại cỏc thời điểm khỏc nhau sau khi pha và ở nhiệt độ 250C. Kết quả được chỉ ra ở hỡnh 3.2 và bảng 3.2.
Hỡnh 3.2. Phụ̉ hṍp thụ của dung dịch chuõ̉n PAR(1) và CPM (2) ở cỏc thời gian khỏc nhau sau khi pha
Bảng 3.2 là kết quả độ hấp thụ quang ở bước súng cực đại của PAR là 244nm và CPM là 264 nm tại cỏc thời điểm khỏc nhau sau khi pha và ở nhiệt độ 250C. Cỏc giỏ trị ghi trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của 5 lõ̀n đo.
Bảng 3.2 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PAR và CPM theo thời gian
Thời gian (phỳt) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A PAR 0,522 0,524 0,528 0,530 0,532 0,532 0,534 0,535 0,536 CPM 0,303 0,303 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 Thời gian (phỳt) 50 55 60 65 70 75 80 85 90 A PAR 0,536 0,536 0,536 0,536 0,536 0,536 0,536 0,536 0,536 CPM 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 0,302 (1) (2) ) (nm A 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 210 215 219 224 228 233 237 242 246 251 255 260 264 269 273 278 282 287 291 296 300
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn t(phỳt) A (1) (2) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Từ kờ́t quả ở bảng 3.2, biờ̉u diờ̃n sự phụ thuụ̣c của đụ̣ hṍp thụ quang cực đại của PAR ở bước súng 244nm và CPM ở bước súng 264 nm theo thời gian. Kờ́t quả được thờ̉ hiợ̀n ở hình 3.3
Hỡnh 3.3. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PAR(1) và CPM(2) theo thời gian
Nhận xột: Từ kờ́t quả ở bảng 3.2, hỡnh 3.2 và 3.3 nhọ̃n thấy. Trong khoảng thời gian 30 90 phỳt độ hấp thụ quang của dung dịch PAR và CPM trong dung mụi HCl 0,1M tương đụ́i ụ̉n định. Sự thay đổi chủ yếu xảy ra trong khoảng từ 5ữ25 phỳt sau khi pha, nhưng sự thay đổi này khụng đỏng kể. Như vậy, cú thể núi dung dịch PAR và CPM cú độ hấp thụ quang ổn định trong khoảng thời gian từ 30ữ 90 phỳt sau khi pha. Tuy nhiờn, trong quá trình thực nghiợ̀m các phép đo quang chủ yờ́u được thực hiợ̀n trong khoảng 20 40 phỳt sau khi pha . Vỡ vậy , chỳng tụi lựa chọn thời gian tối ưu cho phép đo quang là 30 phỳt sau khi pha.
3.4. Khảo sỏt sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của paracetamol và clopheninamin maleat theo nhiệt độ theo nhiệt độ
Tiến hành pha cỏc dung dịch PAR cú nồng độ 8 g/mL và CPM cú nồng độ là 15g/mL, sau khi pha dung dịch 30 phỳt tiến hành đo đụ̣ hṍp thụ quang của cỏc dung dịch ở bước súng 210-300 nm ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau. Kết quả được chỉ ra ở hỡnh 3.4 và bảng 3.3.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hỡnh 3.4. Phụ̉ hṍp thụ của dung dịch chuõ̉n PAR(1) và CPM(2) ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau
Bảng 3.3 là kết quả độ hấp thụ quang ở bước súng cực đại của PAR là 244nm và CPM là 264 nm ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau, sau khi pha 30 phỳt. Cỏc giỏ trị ghi trong bảng là giá trị trung bình của 5 lõ̀n đo.
Bảng 3.3. Sự phụ thuụ̣c độ hấp thụ quang của PAR và CPM theo nhiệt độ
Nhiệt độ 250 C 300 C 350 C 400 C 450 C 500 C
APAR 0,529 0,531 0,538 0,527 0,528 0,526
ACPM 0,291 0,302 0,286 0,286 0,288 0,303
Từ kết quả ở bảng 3.3, xõy dựng được đường biểu diễn sự phụ thuộc đụ̣ hṍp thụ quang cực đại của PAR ở bước súng 244nm và CPM ở bước súng 264 nm theo nhiệt độ. Kết quả được thể hiện ở hỡnh 3.5.
Hỡnh 3.5. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PAR(1) và CPM(2) theo nhiệt độ
(1) (2) ) (nm 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 210 215 219 224 228 233 237 242 246 251 255 260 264 269 273 278 282 287 291 296 300 A T0C (1) (2) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 25 30 35 40 45 50
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhận xột: Từ kết quả ở bảng 3.3, hỡnh 3.4 và 3.5 nhận thấy độ hấp thụ quang của dung dịch PAR và CPM ổn định trong khoảng nhiợ̀t đụ̣ từ 25 đến 500C, nờn cú