- Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm. Qua kết quả từ các thí nghiệm (mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần), lấy kết quả trung bình để chọn ra thông số tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo và cũng chính là thông số tối ưu của quá trình nghiên cứu.
2.4.1 Khảo sát những một số chỉ tiêu của nguyên liệu
- Ở thí nghiệm này, chúng tôi chỉ tiến hành lấy nguyên liệu (dịch điều) và đo các thông số như: nồng độ chất khô (oBx), pH, hàm lượng đường tổng, hàm lượng đường khử.
- Kết hợp với đánh giá màu sắc, hương và vị của dịch quả thu được để chọn thời gian tối ưu cho quá trình.
2.4.2 Khảo sát hàm lượng lòng trắng trứng sử dụng để khử tannin trong dịch điều dịch điều
- Quả điều sau khi được ép lấy dịch, phải được đem đi sử lý tách tannin ngay để tránh các phản ứng oxy hóa làm ảnh hưởng đến chất lượng nước.
- Để tách được tannin ra khỏi dịch quả điều, chúng tôi sử dụng phương pháp tách tannin bằng lòng trắng trứng. Ở đây tôi tiến hành khảo sát lượng lòng trắng trứng nào là phù hợp nhất trong việc tách tannin đề đạt hiệu quả cao nhất. - Với bản chất tannin tạo tủa với protein , nên nếu muốn tăng diện tích tiếp xúc giữa protein và dịch quả, lòng trắng trứng cần được đánh bông và khuấy đều với dịch quả rồi để yên khoảng 20-30 phút, sau đó đem gia nhiệt 850 C để tạo tủa sau cùng ta đem lọc bỏ tủa.
Bảng 2.1 Khảo sát hàm lượng lòng trắng trứng sử dụng khử tannin Hàm lượng lòng trắng trứng sử dụng (g/l) Hàm lượng tannin trong 1 lít dịch ban đầu(g/l) Hàm lượng tannin sau khi khử bằng lòng trắng trứng(g/l) Hiệu suất (H%) Nồng độ chất khô sau khi
khử tannin (0Bx) 0 1 2 3 4 5 6 7
- Sau khi khử tannin bằng lòng trắng. Ta đem dịch điều xác định hàm lượng tannin còn lại trong điều bằng phương pháp xác định hàm lượng tannin bằng KMnO4 .
Mục tiêu: tách tannin ra khỏi dịch điều, tannin gây ức chế cho quá trình lên men. Hàm lượng tannin còn lại trong dịch điều sau khi khử, không ảnh hưởng đến quá trình lên men.
2.4.3 Khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men trong 24 giờ đầu - Chủng nấm men là một yếu tố quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm. - Chủng nấm men là một yếu tố quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm. Ở mỗi chủng nấm men có quá trình sinh trưởng và phát triển khác nhau.
- Theo lý thuyết quá trình tăng sinh khối của chủng nấm men S. cerevisiae
thay đổi nhiều ở 24 giờ đầu tiên sau khi cấy giống. Vì vậy, chúng tôi chỉ khảo sát ở khoảng thời gian này. Do vấn đề quan tâm là thời điểm nào thích hợp
định mật độ tế bào nấm men là chủ yếu. Bên cạnh đó, chúng tôi xác định tỷ lệ tế bào nẩy chồi trong khoảng thời gian tế bào nấm men bắt đầu sinh trưởng mạnh đến giai đoạn suy thoái.
- Mục tiêu : xác định số lượng tế bào sống cao nhất.
Bảng 2.2 Khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men trong 24 giờ đầu
2.4.4 Khảo sát nồng độ chất khô (0Bx) ảnh hưởng đến hàm lượng etanol trong quá trình lên men rượu
- Ở thí nghiệm này, chúng tôi muốn khảo sát hàm lượng etanol sinh ra khi lên men. Vì hàm lượng etanol là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình lên men giấm.
- Dung dịch điều sau khi đã khử tannin. Tiến hành điều chỉnh độ Bx theo thứ tự tăng dần.
- Sau 3 ngày lên men, ta tiến hành chưng cất cồn để xác định nồng độ cồn sau khi men.
Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ chất khô ảnh hưởng đến hàm lượng etanol
Thời gian Thông số 0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 22 24 Mật độ tế bào (tế bào/1ml) Tỷ lệ nẩy chồi (%) Không khảo sát Độ Bx 12 14 16 18 20 22 pH 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 Tỷ lệ giống (%) 6 6 6 6 6 6 Nhiệt độ (0C) 28 28 28 28 28 28 Thời gian (h) 72 72 72 72 72 72 Hàm lượng
- Mục tiêu: tạo hàm lượng etanol tối ưu cho quá trình lên men giấm. 2.4.5 Khảo sát tỷ lệ giống ảnh hưởng đến lượng acid acetic sinh ra. Phương pháp thực hiện.
- Sau khi gạn bỏ men rượu ta tiến hành khảo sát. Chuẩn bị 4 bình tam giác chứa sẵn 100 ml dịch đã lên men rượu .
Bảng 2.4 Khảo sát tỷ lệ giống ảnh hưởng đến hàm lượng acid acetic Tỷ lệ giống (%) 10 15 20 25 30
pH 3,86 3,86 3,86 3,86 3,86 Nhiệt độ lên men (0C) 28 28 28 28 28 Thời gian lên men (h) 96 96 96 96 96 Tốc độ lắc (v/p) 200 200 200 200 200 Hàm lượng etanol (%)
V NaOH chuẩn độ (ml)
- Sau 96 giờ lên men, chúng tôi đem dung dịch mẫu chuẩn độ với NaOH 0,1N và thuốc thử Phenoltalein để xác định hàm lượng acid acetic sinh ra.
Mục tiêu: nhận biết tỷ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men giấm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.6 Khảo sát pH ảnh hưởng đến lượng acid acetic sinh ra
- Sau khi khảo sát tỷ lệ giống chúng tôi lấy thông số tối ưu, và tiến hành lên khảo sát chỉ tiêu pH.
Bảng 2.5 Khảo sát pH ảnh hưởng đến hàm lượng acid acetic
-
pH 3,86 4,2 4,5 4,8 Tỷ lệ giống (%) 15 15 15 15 Thời gian lên men (h) 96 96 96 96 Nhiệt độ ( 0C) 28 28 28 28 Tốc độ lắc (v/p) 200 200 200 200 Hàm lượng etanol (%)
- Sau 96 giờ lên men, chúng tôi đem dung dịch mẫu chuẩn độ với NaOH 0,1N và thuốc thử Phenoltalein để xác định hàm lượng acid acetic sinh ra.
Mục tiêu : tạo pH tối ưu cho quá trình lên men giấm. 2.4.7 Đánh giá một số chỉ tiêu của sản phẩm [9] - Màu sắc, mùi vị và độ trong của sản phẩm.
- Hàm lượng etanol còn sót lại sau quá trình lên men giấm . - Hàm lượng acid acetic sinh sau khi lên men.
2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp vi sinh [1]
2.5.1.1Phương pháp làm môi trường Hansen [1]
- Mục đích: Tạo môi trường thạch nghiêng dùng để giữ nấm men. Thành phần môi trường Hansen như bảng 3.2.
Bảng 2.6. Công thức môi trường Hansen
STT Thành phần Hàm lượng (gam) 1 2 3 4 5 6 Glucose Peptone KH2PO4 MgSO4 Agar H2O cất 50 10 3 3 20 1000ml Điều chỉnh pH về 6
- Cách thực hiện: cân chính xác riêng biệt từng thành phần dinh dưỡng. Hòa tan các thành phần và phân phối vào khoảng ¼ ống nghiệm. Môi trường này được tiệt trùng trong nồi autoclave (ở 121oC trong 20 phút). Sau khi tiệt trùng, ta đặt nghiêng ống nghiệm cho đến khi thạch đông hoàn toàn.
2.5.1.2 Phương pháp làm môi trường nước chiết malt [6]
- Mục đích: chuẩn bị môi trường nuôi cấy dạng lỏng thích hợp để nhân giống nấm men.
- Cách thực hiện:
+ Malt xay nhuyễn, ngâm malt : nước theo tỷ lệ 1: 4 .
+ Lọc và hấp khử trùng trong nồi autolave thời gian 20 phút, nhiệt độ 121oC.
+ Lọc lần 2 và chỉnh nồng độ chất khô đạt khoảng 8 ÷ 10 oBx. - Hấp lần 2 với thông số tương tự như lần 1.
2.5.1.3 Phương pháp nhân giống nấm men[6]
- Giống nấm men trước khi lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối và tăng hoạt lực giống. Ở qui mô phòng thí nghiệm ta nhân giống qua 2 cấp.
2.5.1.3.1. Nhân giống cấp 1
- Mục đích: tạo điều kiện môi trường để tăng sinh khối nấm men
- Phương pháp: sử dụng môi trường nước chiết malt. Nấm men từ môi trường thạch nghiêng được cấy chuyền sang bình tam giác chứa 20ml môi trường nước chiết malt và thực hiện lắc trên máy lắc khoảng 6 ÷ 10 giờ với vận tốc 200 vòng/1phút.
2.5.1.3.2 Nhân giống cấp 2
- Mục đích: tạo điều kiện để nấm men quen dần với môi trường lên men. Tăng sinh khối chuẩn bị cho quá trình lên men.
- Phương pháp: dịch điều và nước chiết malt được điều chỉnh về 8 ÷ 10oBx. Sau đó, lấy 50ml dịch điều và 50ml nước chiết malt vào bình tam giác 250ml, đem đi tiệt trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC thời gian 20 phút. Chuyển nấm men từ ống nghiệm đã nhân giống cấp 1 và cấy vào môi trường trên, thực hiện lắc trên máy lắc trong khoảng 16 giờ với vận tốc 200 vòng/1phút.
2.5.1.4 Phương pháp đếm tế bào nấm men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mục đích: xác định số lượng tế bào nấm men trong 1ml canh trường - Phương pháp:
+ Đếm số tế bào nấm men trực tiếp trên buồng đếm Thoma – Goriaed bằng kính hiển vi quang học.
– Lắc đều canh trường, lấy một giọt canh trường nhỏ vào buồng đếm có gắn sẵn lamelle.
– Đếm số tế bào trong 5 ô lớn. Nếu số lượng tế bào quá nhiều thì pha loãng bậc 10 để dễ dàng đếm.
– Quy tắc đếm là những tế bào nằm ở ô bên trên và bên phải thì tính cho ô đó. Bên trái và phía dưới thì không tính cho ô đang đếm. Tế bào con có kích thước lớn hơn ½ tế bào mẹ thì tính là 2 tế bào. Nếu ngược lại thì tính là 1 tế bào đang nẩy chồi.
Tính kết quả
Số tế bào trong 1ml canh trường: N = f b n * 10 * 4 * 6 (tế bào/1ml) (2.1) n: số tế bào trong 5 ô lớn. b: số ô nhỏ trong 5 ô lớn. f: tỷ lệ pha loãng canh trường.
2.5.1.5 Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào nẩy chồi
- Cách thực hiện: phiến kính và lá kính được vô trùng bằng cồn 70o, nhỏ một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH lên trộn đều, đậy lá kính lại. Quan sát trên kính hiển vi. Đếm số tế bào chung. Đếm số tế bào nẩy chồi. Từ đó suy ra kết quả.
Tỷ lệ tế bào nẩy chồi được xác định như sau: Xnc =
N Nnc
* 100 (2.2) Trong đó: Xnc: Tỷ lệ tế bào nấm men nẩy chồi (%).
- Lập bảng kết quả cho mật độ tế bào nấm men, tỷ lệ tế bào nẩy chồi. Dựa trên kết quả này xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men để xác định thời gian cấy giống vào dịch lên men.
2.5.1.6 Hoạt hóa giống
- Mục đích: tạo ra lượng dịch sinh khối lớn chuẩn bị cho quá trình lên men. - Phương pháp: lấy 50 ml dịch rượu sau khi lên men và 50 ml dịch môi trường giữ giống (không có thành phần agar). Cho vào bình tam giác 250 ml đã được
tiệt trùng. Sau đó, cấy vi khuẩn A.aceti vào dịch đã được phối trộn. Đem nuôi cấy trong vòng 72 h. Ta thu canh trường chứa sinh khối vi khuẩn A.aceti.
2.5.1.7 Phương pháp làm môi trường giữ giống A.aceti [14]
- Mục đích: giữ giống và làm tăng sinh khối để chẩn bị cho quá trình lên giấm.
- Sau khi nhận được ống giống từ trường đại học Khoa Học Tự Nhiên- TPHCM. Chúng tôi tiến hành làm môi trường thạch nghiêng. Để giữ giống và nhân giống. Sau đây là các thành phần môi trường:
Bảng 2.7 Thành phần môi trường giữ giống A.aceti
STT Thành phần Hàm lượng (gam) 1 2 3 4 5 Glucose Agar CaCO3 Cao nấm men H2O cất 100 25 20 10 1000ml Điều chỉnh về pH=7,5
- Cách thực hiện: cân chính xác riêng biệt từng thành phần dinh dưỡng. Hòa tan các thành phần và phân phối vào khoảng ¼ ống nghiệm. Môi trường này được tiệt trùng trong nồi autoclave (ở 121oC trong 20 phút). Sau khi tiệt
2.5.1.8 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1ml canh trường [1] - Phương pháp thực hiện: lấy 7 ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trên mỗi ống có dãn nhãn với độ pha loãng 10-1 - 10-7. Sau đó, lấy 1 ml dịch giống cho vào ống nghiệm với độ pha loãng 10-1. Lắc đều, sau đó lấy 1 ml dịch của ống nghiệm này cho vào ống với độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục cho đến ống nghiệm sau cùng. Sau đó, chúng tôi pha 250 ml môi trường cao thịt- pepton dùng để đổ đĩa.
Lưu ý: nhiệt độ môi trường cao thịt-pepton sau khi tiệt trùng phải 45-500C. Khi đổ đĩa phải xoay đều để môi trường được trãi đều khắp đĩa. Sau đó ủ ở nhiệt độ phòng.
Bảng 2.8 Thành phần môi trường cao thịt –pepton STT Thành phần Hàm lượng (gam) 1 2 3 4 6 Cao thịt Agar Pepton NaCl H2O cất 3 15 10 5 1000ml Điều chỉnh về pH=6 2.5.1.9 Đọc kết quả [1]
- Đếm tất cả các khuẩn lạc đã mọc trên đĩa petri . Ghi nhận các nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc từ 1ml mẫu. Tính toán số tế bào sống theo công thức sau:
S = ( 1* 1* 1 2 * 2 * 2 ... * * ) K N d V N d V Ni di Vi (2.3) Trong đó:
S : Là tế bào sống có trong 1 ml mẫu ban đầu.
∑K : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cà các đĩa petri đã chọn. Ni : Số đĩa đếm được phù hợp ở dung dịch pha loãng thứ i.
Vi: thể tích mẫu đem đổ đĩa. 2.5.2 Phương pháp hóa lý [13] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.2.1 Xác định pH
- Dụng cụ để xác định pH là máy đo pH của phòng thí nghiệm.
- Cách sử dụng: rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô bằng giấy thấm. Nhúng điện cực vào dung dịch mẫu. Nhấn “read” và đọc giá trị trên màn hình. Sau khi đọc xong rửa sạch điện cực bằng nước cất. Lau khô và cho điện cực vào dung dịch KCl 3M.
2.5.2.2 Xác định nồng độ chất khô hòa tan (oBx) bằng khúc xạ kế - Dụng cụ: Brix kế Walklap của phòng thí nghiệm.
- Cách sử dụng: dùng nước cất rửa bình và lau khô bằng giấy thấm. Chỉnh độ khô về 0. Lấy 1 giọt dung dịch cần đo và cho lên mặt kính đậy nắp kính lại. Quan sát và đọc nồng độ chất khô qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Sau khi đọc xong, rửa kính bằng nước cất và lau khô bằng giấy thấm.
2.5.3 Phương pháp hóa sinh [8]
2.5.3.1Định lượng đường khử và đường tổng bằng phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử Ferrycyanua [8]
- Nguyên tắc: khi cho Ferrycyanua (K3Fe(CN)6) phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được là Ferrocyanua. Dựa vào thể tích đường khử đã chuẩn độ, suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm (NaOH) khi đun nóng với chỉ thị xanh methyl.
Phương trình phản ứng:
CH2OH-(CHOH)4CHO + K3Fe(CN)6 +2NaOH
CH2OH-(CHOH)4COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O[8]
2.5.3.2 Xác định hàm lượng đường khử [8]
- Tiến hành: lấy 10ml dung dịch mẫu cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch 100 bằng nước cất. Lắc đều và lấy chính xác 50ml rót vào buret 25ml để định lượng đường khử.
- Cho vào bình tam giác 100 đúng 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 2,5ml dung dịch NaOH 2,5N. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp điện.
- Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của K3Fe(CN)6. Điểm dừng chuẩn độ khi màu vàng chanh vừa biến mất, dung dịch trong suốt không màu khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của K3Fe(CN)6 .
- Đọc thể tích trên buret.
- Thí nghiệm được lặp lại 4 lần, ở lần chuẩn độ đầu tiên làm rất chậm, xả từng giọt dung dịch chứa đường khử trên buret để xác định thời điểm xảy ra phản ứng, ghi lại thể tích đọc được trên buret. Kết quả của lần chuẩn độ đầu tiên chỉ là giới hạn cho các lần chuẩn độ kế tiếp. Vì vậy, chỉ lấy kết quả ở 3 lần chuẩn độ sau. Khi đó ta có Vk1, Vk2, Vk3. Suy ra :
Vk = 3 3 2 1 k k k V V V Trong đó: Vk: Thể tích dung dịch chứa đường khử trung bình.
Vk1: Thể tích dung dịch chứa đường khử ở lần chuẩn độ 1. Vk1: Thể tích dung dịch chứa đường khử ở lần chuẩn độ 2. Vk1: Thể tích dung dịch chứa đường khử ở lần chuẩn độ 3.