1.2.6.1 Đặc điểm chung
- Là trực khuẩn khá lớn.Vi khuẩn Acetobacter có tế bào hình bầu dục, hình
gậy thẳng, hoặc hơi cong kích thước khoảng 0,6-0,8 x 1,0-3,0 μm.
- Hiện diện ở dạng đơn, dạng sợi hay chuỗi. Một số loại thường ở dạng xoắn và có thể hình cầu, hình que phình ra, hình chùy, một số ở dạng vòng, phân nhánh hay dạng sợi.
- Di động bằng tiên mao hay bất động, không tạo nội bào tử. Khi còn non tế bào Gram âm, khi về già một số chủng có Gram thay đổi .
- Trao đổi chất bằng hô hấp, oxy là chất nhận điện tử cuối cùng. - Nhiệt độ tối thích (top) là 30oC.
- pH tối thích (pHop) từ 5,4-6,3 một số phát triển được ở môi trường kiềm (pH=7,8).
- Vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trên thực phẩm rau quả, nước trái cây, giấm, rượu có gas … Trong nhiều trường hợp vi khuẩn acetic phát triển đồng thời với nấm men trên các cơ chất thực vật có nhiều đường.
- Vi khuẩn Acetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, tốc độ sinh trưởng của
chúng rất nhanh, từ một tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng oxy hóa etanol tạo thành acetic acid. Với nồng độ acetic acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng và phát triển của chúng.
1.2.6.2 Đặc điểm phân loại đến cấp giống
1.2.6.2.1 Acetobacter aceti (Pasteur)
- Trực khuẩn ngắn, không di động, không sinh bào tử thường kết lại với nhau thành chuỗi dài, váng vi khuẩn bắt màu vàng khi nhuộm với thuốc nhuộm iod
- Nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng là 34oC.
- Đòi hỏi các acid amin trong môi trường như acid pantothenic, acid nicotinic.
1.2.6.2.2 Acetobacter pasteurianum (Hansen)
- Hình que ngắn, thường hình thành dạng xoắn. Một số dòng có màng capsule hay sản xuất slime, váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, tế bào chất có màu xanh khi nhuộm vời thuốc nhuộm iod .
- Không tạo cellulose.
- Không có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu cao. - Panthothenic, p-aminobenzoic và acid niotinic cần cho sự phát triển.
1.2.6.2.3 Acetobacter peroxydans
- Hình que đường kính 0,5 μm, dài 2-3 μm, thường thấy ở trạng thái đôi hay chuỗi ngắn. Không hình thành thể xoắn, di động.
- Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 20-25oC, không mọc ở 40oC. - Có trong rượu, đường …
1.2.6.2.4 Acetobacter xylinum
- Trực khuẩn không di động, tạo thành váng khá dày và nhăn nheo. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iod sẽ bắt màu xanh.
- Có thể tạo ra đến 4,5% acid acetic trong môi trường thuận lợi. Không sinh sắc tố.
- Không phát triển trên môi trường có rượu. 1.2.7. Ứng dụng và tác hại [4]
1.2.7.1 Ứng dụng
- Vi khuẩn acetic được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là sự chuyển hóa các chất. Nhờ vậy mà các sản phẩm trao đổi của chúng rất đa dạng và có ý nghĩa đáng lưu ý nhất là acid acetic.
- Ở các nước phát triển một khối lượng lớn giấm được sản xuất ra bằng phương pháp lên men chìm là chủ yếu. Tuy vậy công việc lên men vẫn phần nào phụ thuộc vào phương pháp truyền thống và kinh nghiệm của nhà nhà sản xuất. Chủng giống là một hỗn hợp, không phải chủng thuần, hàm lượng acid acetic trong giấm đạt từ 11-12 %. Bằng phương pháp chọn giống, đã có những công bố gần đây hàm lượng acid acetic đã đạt lên đến 18% trong phòng thí
nghiệm.Việc gia tăng hàm lượng acid acetic không đơn giản vì bản thân sản phẩm (acid acetic) lại trở thành một tác nhân ức chế quá trình này.
- Một số sản phẩm khác được ứng dụng như dùng vi khuẩn sản xuất vitamin, thạch dừa, ngoài ra người ta còn dùng sự lên men oxy hóa của chúng để chế biến một loại thức uống giải khát như ở Nga người ta kết hợp cả hai quá trình lên men rượu và lên men acid acetic.
1.2.7.2 Tác hại
- Vi khuẩn, cùng với nấm men và nấm mốc, được dùng để chế biến các thực phẩm lên men như phô-mai, dưa chua, nước tương, dưa cải bắp giấm, rượu, và yoghurt. Sử dụng công nghệ sinh học, các vi khuẩn có thể được "thiết kế" để sản xuất thuốc trị bệnh như insulin, hay để cải thiện sinh học đối với các chất thải độc hại. Tuy nhiên nó cũng có một số tác hại như: trong ngành công nghiệp lên men rượu, bia, nước giải khát …thì có thể làm cho rượu bị váng trắng, đục và có vị chua Vì vậy người ta thường hạn chế sự xâm nhập của vi khuẩn này.
1.3 CƠ SỞ QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETIC[4] 1.3.1 Cơ chế
- Giấm được sản xuất dự trên cơ sở của sự oxy hóa rượu thành acid acetic trong các môi trường khác nhau dưới tác dụng của của vi khuẩn
Acetobacter.
- Bản chất của quá trình này được Kiitzing nêu lên lần đầu năm 1838 và được Pasteur xác nhận năm 1868. Quá trình oxy hóa này qua hai giai đoạn.
Rượu acetaldehyd.
Acetaldehyd bị hydrat hóa acid acetic. - Phương trình tổng quát:
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O +117Kcal - Thực chất quá trình oxy hóa này qua các giai đoạn sau:
B1: C2H5OH + O2 CH3CHO +H2O.
CH3COOH CO2
C2H5OH
Môi trường Tế bào Môi trường
- Để chuyển hóa rượu thành acid acetic, trước tiên rượu và oxy phải thâm nhập vào tế bào vi khuẩn. Dưới tác dụng của các enzym oxy hóa có trong tế bào vi khuẩn nó sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic và sau đó acid acetic sẽ thoát ra khỏi tế bào vào môi trường.
Ngoài khả năng chuyển hóa cồn thành acid acetic chúng còn có khả năng tham gia chuyển hóa một số các rượu khác thành acid tương ứng và các chất khác như chuyển hóa rượu propylic thành acid propionic, butanol thành acid butalic, glycerin thành dioxyaceton.
1.3.2 Nguyên liệu [12]
- Từ cơ chế quá trình lên men ta thấy bất cứ một sản phẩm nào có thể lên men rượu đều có thể là nguyên liệu để lên men giấm. Nguyên liệu trưc tiếp vẫn là etanol nhưng hiện nay có ba loại nguyên liệu chính khác.
+ Nguyên liệu từ tinh bột: thường đi từ các loại ngũ cốc, hạt củ.
+ Nguyên liệu từ chứa đường: thường đi từ mật rỉ, dung dịch đường, dịch ép trái cây…
+ Nguyên liệu chứa cellulose: rơm rạ, gỗ vụn, mạt cưa…nhưng trước hết phải chuyển chúng thành đường bằng các tác nhân đường hóa như acid, kiềm enzym cellulase
- Nếu dùng nguyên liệu có tinh bột thì phải qua hai khâu trung gian là chuyển hóa tinh bột, đường nhờ enzym amylase rồi tiếp tục lên men rượu nhờ enzym deareloxylase của vi sinh vật. Sau đó mới lên men giấm cho ra acid acetic.
- Nếu dùng nguyên liệu có đường thì chỉ có giai đoạn chuyển thành rượu sau đó lên men tạo acid acetic.
- Nếu nguyên liệu có rượu etanol thì sẽ lên men trực tiếp tạo acid acetic. - Trong công nghiệp người ta dùng rượu cất pha loãng để lên men, yêu cầu rượu cất không có lẫn dầu fuzel vì nó có tác dụng ức chế hoạt động của vi sinh vật mặt khác rượu cất có thể lên men từ nhiều nguồn khác nhau như ngũ cốc, rĩ đường … . Hiện nay người ta còn dùng nước ép trái cây để làm giấm. Nói chung nguồn nguyên liệu để sản xuất giấm rất phong phú đa dạng và rẻ tiền .
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men[4] -Ta có thể tóm tắt quá trình lên men như sau: -Ta có thể tóm tắt quá trình lên men như sau:
Môi trường trước lên men Môi trường sau lên men
- Acid acetic được tạo thành chính do các tế bào sản sinh ra do vậy tác động quan trọng nhất đối với quá trình lên men là thành phần môi trường, nhiệt độ, độ thông thoáng. Sự thay đổi của các thông số này sẽ dẫn đến sự thay đổi của tốc độ sinh sản, sinh khối, nồng độ acid acetic.
1.3.3.1 Thành phần môi trường [10]
- Ngoài nguyên liệu chính là rượu, nước còn chần chất dinh dưỡng như đường, muối khoáng, chất nitơ để dễ đồng hóa (muối amôn).
- Tùy theo chủng mà nồng độ rượu thay đổi từ 6-15% là phù hợp, trung bình 10-11%. Khi không có rượu trong môi trường thì vi khuẩn sẽ oxy hóa tiếp acid acetic thành CO2 và H2O để nhận năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình .
CH3COOH +2O2 CO2 + 2H2O
- Do vậy trong môi trường lên men bao giờ cũng cần một lượng tối thiểu là 0,3-0,5% rượu. Để vi khuẩn có thể dùng cồn mà không dùng acid acetic như Cơ chất + Giống vi sinhvật Cơ chất sót + sinh khối vi
sinh vật + sản phẩm trao đổi chất ngoại bào do vi sinh vật tổng hợp nên
- Trong sản xuất giấm, thường người ta cho vào dung dịch ban đầu một lượng giấm nhất định để acid hóa môi trường nhằm ngăn chặn sự phát triển các loài vi sinh vật có hại và không có lợi cho quá trình lên men, vì bản thân acid acetic cũng là một chất độc cho chúng, và đưa vào dịch lên men một lượng giống đủ để quá trình đạt tốc độ cao.
- Ngoài ra để vi khuẩn giấm phát triển tốt, oxy hóa nhanh khi sản xuất người ta còn bổ sung thêm các nguyên tố không cần thiết. Nếu sản xuất giấm từ rượu vang bia nước ép trái cây thì trong dịch lên men đã có đủ các nguyên tố khoáng nên không cần bổ sung Nếu sản xuất từ dịch cồn pha loãng thì cần bổ sung các nguyên tố khoáng đa lượng cần thiết nhờ các muối vô cơ dễ tan. Hàm lượng và thành phần các chất bổ sung tùy thuộc vào nguyên liệu sử dụng và chủng vi khuẩn nên mỗi cơ sở sản xuất đều đưa ra hàm lượng các chất dinh dưỡng khác nhau vào các môi trường lên men.
- Người ta có thể thêm vào các chất sau: glucose; diphosphat amon, diphosphat kali, sunfophosphat…(nồng độ thường trong khoảng 0,1-0,5%); muối vô cơ: sunfat amon, muối nitrat…
1.3.3.2 Các chất độc hại và kim loại nặng
- Các chất độc hại và ức chế như tinh dầu, tannin, …, và một số hợp chất khác khi có mặt trong môi trường lên men với nồng độ vượt quá mức cho phép đều bất lợi cho vi khuẩn.
- Các kim loại nặng: Pb, Cu, Fe, Zn, Sn trong dung dịch lên men sẽ làm giảm hiệu suất lên men. Mức độc hại của 5 kim loại trên là :10, 15, 100, Zn và Sn > 100 ppm.
1.3.3.3 Nhiệt độ
- Nhiệt độ môi trường lên men ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sinh lý sự phát triển của vi sinh vật, do đó ảnh hưởng đến quá trình lên men. Ngoài ra yếu tố này cũng là một yếu tố quyết định tốc độ lên men.
- Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển đối với mỗi loài thì khác nhau.
- Nếu nhiệt độ quá thấp thì quá trình sinh trưởng của vi khuẩn sẽ chậm dẫn đến tốc độ quá trình lên men cũng chậm .
- Nếu nhiệt độ cao thì acid, rượu sẽ bay hơi, đồng thời cũng là tác nhân ức chế hoạt động của chúng (do đình chỉ sinh sản của tế bào).
- Nhiệt độ thích hợp là 30-34oC. 1.3.3.4 pH
- Để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển tốt ta thêm một ít acid acetic để tạo pH acid ban đầu thích hợp cho vi khuẩn và ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật có hại.
- Thường thì ta thêm 2-3% acid acetic để pH của môi trường ở khoảng 3. Nếu ta sử dụng một lượng quá cao sẽ hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và giảm khả năng lên men .
1.3.3.5 Độ thoáng khí
- Lên men acid acetic là quá trình lên men hiếu khí mà oxy là chất nhận hydro nên đòi hỏi sự có mặt nhiều oxy và đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Do vậy điều kiện thoáng khí càng tốt thì oxy hóa càng nhanh.
- Từ phương trình tổng quát ta thấy về mặt lý thuyết để oxy hóa hế một mol rượu ta cần 1 mol oxy tự do tức là để oxy hóa hết 1 kg rượu khan thì cần 2,3 m3 không khí chứa 20,9% oxy ở điều kiện chuẩn. Nhưng một số tác giả cho rằng lượng oxy thực tế lớn gấp 2 lần lượng oxy cần theo phương trình tổng quát. Trong sản xuất quá trình thông khí càng tốt hay nói cách khác bề mặt tiếp xúc giữa không khí và bề mặt lên men càng lớn thì hiệu quả và năng suất càng cao.
1.3.3.6 Nồng độ acid acetic sinh ra
- Acid acetic được sinh ra trong quá trình lên men có ảnh hưởng lên sự hoạt động của vi khuẩn. Khi nồng độ acid acetic khoảng 8%, vi khuẩn bắt đầu hoạt động yếu và nồng độ khoảng 12-14% thì hoàn toàn đình chỉ hoạt động của các vi khuẩn này.
- Có tác giả cho rằng ngay ở nồng độ 7% acid acetic đã nguy hiểm cho vi khuẩn giấm nên thường lấy trong khoảng khá lớn từ 1-7%.
- Thời gian lên men quá dài: thì không kinh tế và lượng acid tổn thất nhiều.
- Thời gian lên men quá ngắn: không đủ cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển, quá trình oxy hóa không kịp diễn ra nên lượng acid sinh ra thấp.
1.3.3.8 Giống
Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn. Như ta đã biết thì khi lượng giống tăng thì lượng acid cũng tăng (trong giới hạn) và thời gian lên men sẽ được rút ngắn. Nếu lượng giống lớn, mật độ dày đặc thì sẽ nhanh chóng dẫn đến pha suy vong, tốn giống và không kinh tế. Tóm lại phải sử dụng một lượng giống vừa phải nhưng tạo được lượng acid cao nhất.
1.3.4 Các phương pháp lên men [4] 1.3.4.1 Lên men chậm 1.3.4.1 Lên men chậm
- Phương pháp truyền thống có từ lâu đời.
- Quá trình lên men diễn ra ở bề mặt tiếp xúc giữa khối dịch lên men và không khí vi khuẩn phát triển tạo thành màng trên mặt thoáng.
- Dịch lên men pha theo tỷ lệ rượu : acid acetic là 4:2 hay 3:3. - Độ acid đạt được lên đến 5-6%.
- Do hạn chế của mặt thoáng nên phương pháp này có nhược điểm thời gian lên men dài, nồng độ acid thấp, năng suất thấp.
1.3.4.2 Lên men nhanh
- Đang được ứng dụng rất nhiều hiện nay.
- Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc lớn nhờ bổ sung thêm các vật liệu bám trong thiết bị nên hiệu suất cao hơn .
- Tốc độ khá nhanh và liên tục. - Độ acid lên đến 10-11%. - Thời gian 8-10 ngày.
- Nhược điểm là rượu và acid bị tổn thất và vật liệu bám tốn kém. 1.3.4.3 Lên men chìm
- Phương pháp này có sục không khí qua khối dịch lên men, nên tăng cường khả năng tiếp xúc giữa oxy và dịch lên men .
- Nhược điểm thiết bị phức tạp tính ổn định không cao, phải cung cấp oxy liên tục vì vi khuẩn nằm lơ lửng bên trong dịch lên men nên rất nhạy cảm với việc ngưng cấp oxy dù là gián đoạn.
1.3.4.4 Phương pháp tổ hợp
- Là phương pháp lai giữa phương pháp lên men nhanh và chìm nên khi ngưng cung cấp oxy qua bộ sục khí thì không ảnh hưởng đến vi khuẩn.
1.3.5 Những trường hợp hay gặp của giấm khi lên men [10] 1.3.5.1 Giấm bị đục và giảm độ chua 1.3.5.1 Giấm bị đục và giảm độ chua
Trong sản xuất giấm thường xảy ra hai quá trình oxy hóa 1) Quá trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH
2) Quá trình oxy hóa CH3COOH thành CO2 và H2O
Quá trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH có lợi cho sản xuất. Quá