khối tiền phôi (PEM-proembryo mass):
Tiến hành khảo sát 3 dòng thông nhựa (31, 44, 54) trên 3 môi trường MLV, DCR và TE. Thành phần môi trường cơ bản bổ sung Casein Hydrolysate (1g/l), myo- inositol (1g/l); Glutamine (500mg/l), Sucrose (30g/l); Phytagel (4g/l).
Theo dõi tỉ lệ cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM) sau 6-8 tuần. Kết quả thí nghiệm như
sau:
Bảng 3.1: Tỉ lệ phát sinh phôi trên môi trường MLV, DCR, TE
Dòng Môi trường Tổng số mẫu cấy (%) Tỉ lệ phát sinh phôi (%) Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ chết 54
MLV 251 20.79±3.8a 3.93±3.26a 8.55±2.9a
DCR 235 11.54±2.62b 8.11±4.68a 13.7±4.05a
TE 204 10.23±2.83b 9.32±5.44a 9.97±3.09a 31
MLV 412 12.24 ±2.28a 19.95 ± 5.4ab 13.86±4.41a
DCR 357 11.57 ±2.07a 8.59 ±2.71a 17.13±4.73a
TE 396 9.92 ±1.15b 34.38±6.38bc 16.36±4.3a
44 MLV 251 17.92±3.6a 22.55±6.65a 21.54±6.8a
DCR 210 5.94±2.2b 12.81±6.76a 35.88±8ab TE 240 8.91±3.42ab 23.56±7.1a 45.11±8.65b
Hình 3.1 : Sự khởi tạo PEM trên môi trường cảm ứng (Thước ngang: 1cm) Kết quả trên cho thấy rằng, môi trường MLV cho hiêụ quả tạo thể phát sinh phôi cao nhất trên tất cả các dòng.
Tuy nhiên, môi trường DCR và TE cũng cho hiêụ quả tương đương với dòng 44 và 54. Từ kết quảđó, môi trường MLV được sử dụng để tiếp tục khảo sát quá trình duy trì và tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trong quá trình cảm ứng, cũng ghi nhận được một số dạng khối tiền phôi, mà theo một số thí nghiệm trước đó đã chứng minh ảnh hưởng khác nhau của mỗi dạng đến quá trình tạo phôi soma.
Tiến hành quan sát cấu trúc của khối tiền phôi (PEM), nhận thấy có 2 dạng cấu trúc:
• Dạng A: khối tiền phôi vàng đục, rắn chắc, cấu trúc tương tự như tế bào mô sẹo, gồm rất nhiều tế bào hình cầu gắn kết chặt chẽ với nhau.
• Dạng B: khối tiền phôi trắng đục, mềm, rời rạc, hơi nhầy. Nhuộm và quan sát dưới vật kính 10X, thấy rằng trong khối tiền phôi này, gồm nhiều cấu trúc phân cực. Cực thứ nhất bao gồm nhiều tế bào tròn, tế bào chất đậm đặc bắt màu mạnh với thuốc nhuộm acetocarmine 5%. Cực thứ 2 bào gồm nhiều tế bào dài, hình liềm với tế bào chất rời rạc, không bao lớn.
Dạng A 10X (A) 20X (A)
Dạng B 10X (B) 20X (B)