lâm nghiệp Nam Bộ cung cấp.
2.4 Phương pháp nghiên cứu chung: Kỹ thuật nuôi cấy invitro được áp dụng xuyên suốt quá trình thí nghiệm kết hợp nhuộm và quan sát hình thái tế bào phôi dưới kính hiển vi và mô tả.
2.4.1 Thu nón thông non và xử lý vô trùng:
Nón thông non được thu hái vào thời điểm tháng 6, tháng 7 trong năm. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh 2-60C. Nón thông được sử dụng trong vòng 1 tuần sau khi thu hái.
- Nón thông non được rửa dưới vòi nước máy để loại bỏ chất bẩn bề mặt. Sau
đó, ngâm trong cồn 700C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc.
- Tách nón thông, thu lấy hạt, lột bỏ lớp vỏ lụa thu được thể giao tử cái (megagametophytes) chứa phôi non (immature embryo) và đặt vào môi trường cảm
ứng trong tối ở 25±20C.
Hình 2.2: Vật liệu nuôi cấy
2.4.2 Phương pháp cảm ứng tạo khối tiền phôi (Proembryo mass- PEM):
Phôi non được đặt vào các môi trường cảm ứng MLV (Litvay medium 1985), DCR (Gupta & Durzan,1985), TE (Tang,1998) có bổ sung thêm các thành phần như
casein hydrolysate 1g/l, phytagel 4g/l , Sucrose 3%, Myo-inositol 1g/l, L-Glutamine 500mg/l. Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D) 2,2 mg/l, 6-benzyladenine (BA) 1,1mg/l . Mỗi điã petri chứa 10 phôi non.
2.4.3 Nghiên cứu sự tăng sinh của khối tiền phôi (PEM):
Khối khối tiền phôi (PEM) sau khi được cảm ứng, sẽđược cấy chuyền cứ sau 2- 3 tuần để tăng sinh khối.
Thành phần môi trường tăng sinh cũng tương tự như thành phần môi trường sử
dụng trong quá trình cảm ứng.
Mẫu được nuôi trong điều kiện ánh sáng tối với nhiệt độ 250C±2.
2.4.4 Nghiên cứu sự trưởng thành của phôi:
Đặt khối khối tiền phôi (PEM) vào môi trường trưởng thành. Thành phần môi trường trưởng thành tương tự như trong môi trường cảm ứng và tăng sinh khối. Tuy nhiên, môi trường bị loại bỏ auxin, cytokinin và thêm vào ABA.
Nuôi cấy trong điều kiện tối với nhiệt độ 250C±2.
2.4.5 Phương pháp quan sát hình thái phôi:
Các giai đoạn phát triển của phôi được theo dõi bằng cách nhuộm với 0.5% Acetonecarmine trong 5-7 phút. Quan sát dưới kính hiển vi quan học.
2.4.6 Phương pháp sinh trắc nghiệm đo lượng hocmon nội sinh:
Hoạt tính tổng cộng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật của khối tiền phôi (1gram) PEM trên môi trường trưởng thành sau 0, 10, 25 ngày được xác định nhờ các sinh trắc nghiệm. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: auxin (2,4-D), acid abcisic (ABA) của khối sinh phôi trên môi trường trưởng thành MLV với ABA 60 µM được ly trích.
Sự phân đoạn chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện nhờ phương pháp sắc ký trên bản mỏng silicagel với dung môi di chuyển gồm chloroform: methanol: acid acetic (tỉ lệ theo thể tích 80:15:5). Hoạt tính của các chất này được xác định nhờ
Sinh trắc nghiệm đo hoạt tính ABA:
- Chuẩn bị khây có các ô chứa:
• Ô 1: 10ml dịch ngâm AIA mẫu (Rf = 0.84 – 0.88) sau 24 giờ.
• Ô 2: 10ml dịch ngâm ABA mẫu (Rf = 0.88 – 0.92) sau 24 giờ.
• Ô 3: 10ml dung dịch AIA 1mg/l.
• Ô 4: 10ml dung dịch ABA 1mg/l.
• Ô 5: 10ml nước cất. - Bóc vỏ khoảng 200 hột lúa và ngâm trong dung dịch KMnO4 5%0 (15 phút) để kích thích sự nảy mầm. Hột được rửa sạch và ngâm bão hòa nước khoảng 2 giờ. Sau đó, hột được gieo trên giấy thấm ẩm (hoặc gòn thấm nước) trong thau được
đậy bằng giấy, trong tối. Khoảng 2 ngày sau, diệp tiêu mọc đứng thẳng, cao khoản 15mm. - Cắt diệp tiêu (dưới ánh sáng đỏ): cắt bỏ một đoạn khoảng 5mm ngọn diệp tiêu, cắt bỏ gốc diệp tiêu về phía hột và rút lá mầm ra khỏi diệp tiêu. Dùng dao cắt chuyên biệt (để tạo các khúc cắt diệp tiêu dài Sơđồ2.2: Phương pháp ly trích các CĐHSTTV
bằng nhau). Ởđây nhóm đã dùng các mảnh lam ghép lại với lưỡi lam để tạo thành dao cắt, kích thước đoạn diệp tiêu cắt được dài 2mm
- Các khúc cắt được cho vào một hộp petri chứa nước cất . Sau khi cắt đủ số khúc diệp tiêu cần thiết , dùng kẹp gắp ngẫu nhiên 10 khúc cắt diệp tiêu cho vào mỗi ô trong khây đã chuẩn bị ở phần trên. Đặt các hộp so với chuẩn sẽ thể hiện tác động của các chất kích thích hay cản tăng trưởng. Sai biệt của các chỉ số tăng trưởng diệp tiêu từ
mẫu trích, mẫu chuẩn tinh khiết và đối chứng (trong nước cất) sẽ xác định được hoạt tính tương đương ABA
2.4.7 Phương pháp đo cường độ hô hấp:
Vật liệu đo là các khối tiền phôi PEM (1gram) sau 15, 30, 45 ngày nuôi cấy trên môi trường trưởng thành MLV bổ sung chất điều hòa sinh trưởng ABA 60µM.
Việc đo hô hấp được thực hiện với điện cực Oxygen (Hansatech). Nguyên tắc hoạt
động của máy dựa vào lượng O2 thay đổi trong buồng kín (được phát hiện bằng điện cực nhạy với O2. Cường độ hô hấp được đo trong tối , nhiệt độ 270C.
Thực hiện 3 lần đo cho mỗi thí nghiệm.
2.5 Môi trường nuôi cấy: 2.5.1 Môi trường cảm ứng: 2.5.1 Môi trường cảm ứng:
Sử dụng môi trường MLV (Litvay medium 1985); DCR (Gupta &
Durzan,1985); TE (Tang,1998) cho việc cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM). Môi trường được bổ sung thêm các thành phần như casein hydrolysate 1g/l, phytagel 4g/l , Sucrose 3%, Myo-inositol 1g/l, L-Glutamine 500mg/l. Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 2,2 mg/l, 6-benzyladenine (BA) 1,1mg/l cho cảm ứng tạo khối phát sinh phôi. [18][21]
2.5.2 Môi trường duy trì và tăng sinh khối:
Môi trường duy trì và tăng sinh khôí có thành phần giống như môi trường cảm
ứng.
Tiến hành thay đổi để khảo sát ảnh hưởng của Glutamin (0, 100, 300, 500, 700), nước dừa (0%, 10%, 20%) và loại đường maltose (10%, 20%, 30%), sucrose (10%, 20%, 30%) đến sự tăng sinh khối của khối tiền phôi (PEM). [21]
2.5.3 Môi trường trưởng thành:
Sử dụng môi trường MLV bổ sung casein hydrolysate (1g/l); glutamine (500mg/l), sucrose (50g/l); phytagel (6g/l), PEG-polyethylene glycol 8000 (2%.) Có sự thay đổi khi loại bỏ auxin, cytokinin thay vào đó là bổ sung ABA.
Khảo sát ảnh hưởng của ABA (0, 40, 60, 80, 100μM) đến thời gian, số lượng và sự hình thành phôi trưởng thành.[21]
2.6 Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại trên số lượng mẫu
đảm bảo tính thống kê.
2.7 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu:
• Theo dõi tỉ lệ cảm ứng tạo phát sinh khối tiền phôi (PEM):
Xác định tỉ lệ % sự hình thành thể phát sinh phôi = (số lượng PEM tạo thành x 100%)/số lượng mẫu câý.
• Theo dõi sự sinh trưởng của khối tiền phôi (PEM):
Xác định sự tăng sinh khối trên môi trường đặc bằng cách cân trọng lượng sinh khối trước và sau khi tăng sinh. Từđó tính hệ số tăng sinh khối.
Hệ số tăng sinh khối = trọng lượng sinh khối sau khi nuôi cấy (g) : trọng lượng sinh khối trước khi nuôi cấy (g)
• Thời gian tạo phát sinh phôi:
Theo dõi thời gian tạo thể tiền phôi, tạo lá mầm.
• Tỉ lệ tạo phôi thành thục
• Hình thái, giai đoạn phát triển của quá trình tạo phôi soma
Phân tích kết quả: số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm SPSS 11.5
Nơi thực hiện đề tài: Phân viện nghiên cứu khoa học lâm nghiệp Miền Nam
CHƯƠNG III
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM-proembryo mass): khối tiền phôi (PEM-proembryo mass):
Tiến hành khảo sát 3 dòng thông nhựa (31, 44, 54) trên 3 môi trường MLV, DCR và TE. Thành phần môi trường cơ bản bổ sung Casein Hydrolysate (1g/l), myo- inositol (1g/l); Glutamine (500mg/l), Sucrose (30g/l); Phytagel (4g/l).
Theo dõi tỉ lệ cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM) sau 6-8 tuần. Kết quả thí nghiệm như
sau:
Bảng 3.1: Tỉ lệ phát sinh phôi trên môi trường MLV, DCR, TE
Dòng Môi trường Tổng số mẫu cấy (%) Tỉ lệ phát sinh phôi (%) Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ chết 54
MLV 251 20.79±3.8a 3.93±3.26a 8.55±2.9a
DCR 235 11.54±2.62b 8.11±4.68a 13.7±4.05a
TE 204 10.23±2.83b 9.32±5.44a 9.97±3.09a 31
MLV 412 12.24 ±2.28a 19.95 ± 5.4ab 13.86±4.41a
DCR 357 11.57 ±2.07a 8.59 ±2.71a 17.13±4.73a
TE 396 9.92 ±1.15b 34.38±6.38bc 16.36±4.3a
44 MLV 251 17.92±3.6a 22.55±6.65a 21.54±6.8a
DCR 210 5.94±2.2b 12.81±6.76a 35.88±8ab TE 240 8.91±3.42ab 23.56±7.1a 45.11±8.65b
Hình 3.1 : Sự khởi tạo PEM trên môi trường cảm ứng (Thước ngang: 1cm) Kết quả trên cho thấy rằng, môi trường MLV cho hiêụ quả tạo thể phát sinh phôi cao nhất trên tất cả các dòng.
Tuy nhiên, môi trường DCR và TE cũng cho hiêụ quả tương đương với dòng 44 và 54. Từ kết quảđó, môi trường MLV được sử dụng để tiếp tục khảo sát quá trình duy trì và tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trong quá trình cảm ứng, cũng ghi nhận được một số dạng khối tiền phôi, mà theo một số thí nghiệm trước đó đã chứng minh ảnh hưởng khác nhau của mỗi dạng đến quá trình tạo phôi soma.
Tiến hành quan sát cấu trúc của khối tiền phôi (PEM), nhận thấy có 2 dạng cấu trúc:
• Dạng A: khối tiền phôi vàng đục, rắn chắc, cấu trúc tương tự như tế bào mô sẹo, gồm rất nhiều tế bào hình cầu gắn kết chặt chẽ với nhau.
• Dạng B: khối tiền phôi trắng đục, mềm, rời rạc, hơi nhầy. Nhuộm và quan sát dưới vật kính 10X, thấy rằng trong khối tiền phôi này, gồm nhiều cấu trúc phân cực. Cực thứ nhất bao gồm nhiều tế bào tròn, tế bào chất đậm đặc bắt màu mạnh với thuốc nhuộm acetocarmine 5%. Cực thứ 2 bào gồm nhiều tế bào dài, hình liềm với tế bào chất rời rạc, không bao lớn.
Dạng A 10X (A) 20X (A)
Dạng B 10X (B) 20X (B)
3.2 Cấu trúc hình thái trong quá trình cảm ứng tạo thể phát sinh phôi PEM:
H.a H.b
H.c H.d
H.e H.f
Sau 4-8 tuần đặt trên môi trường cảm ứng, khối tiền phôi (PEM) đã được hình thành (H.a) với cấu trúc trắng đục, nhầy, phát triển lan trên môi trường.
Tiến hình giải phẫu quan sát, thấy rằng các tế bào trong khối tiền phôi (PEM) trải qua một chuỗi trình tự phân chia theo thời gian để từ một tế bào ban đầu phân chia thành cấu trúc lưỡng cực (H.b) với 2 loại tế bào: tế bào tròn với tế bào chất đậm đặc bắt màu tốt với Acetone carmin 5% và tế bào dài hoặc ovan có không bào lớn.
Hai loại tế bào này trải qua quá trình phân bào và phân chia để tăng số lượng (Hình c) tạo thành cấu trúc khối tiền phôi (PEM) II (Hình d).
Cấu trúc khối tiền phôi (PEM) II tiếp tục phân chia, phát triển thành khối tiền phôi (PEM) III và đi vào con đường biệt hóa để tạo thành cấu trúc phôi soma ở pha sớm (Hình e,f).
Kết quả này tương tự như những quan sát của Filonova và ctv.,1999 khi tiến hành khảo sát các giai đoạn phát triển của Picea abies bằng phương pháp time lapse tracking [15].
3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh (Proliferation) khối tiền phôi: nhanh (Proliferation) khối tiền phôi:
Vai trò của nước dừa đến quá trình phát sinh phôi soma đã được chứng minh ở
nhiều loài thực vật 2 lá mầm. Tuy nhiên, đối với họ thông thì những nghiên cứu này còn rất mới mẻ.
Kết quả theo dõi sự tăng sinh khối tiền phôi (PEM) sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần nuôi cấy được thể hiện trên bảng 3.2.
Sau 1 tháng nuôi cấy, khối tiền phôi (PEM) phát triển tăng trọng lượng. Ở dòng 31 (nghiệm thức 3) và 44 (nghiệm thức 1 và 4) ở tuần đầu tiên nhận thấy có sự giảm trọng lượng mẫu cấy, điều này có thể là do một số tế bào khối tiền phôi (PEM) chưa kịp thích nghi với môi trường mới nên chết đi. Tuy nhiên, sau đó, các tế bào còn lại kịp thích nghi và phát triển tăng trọng lượng.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng nước dừa đến sự tăng sinh khối tiền phôi (PEM)
Dòng thí nghiệm 31
NT Nước dừa (%) T1 T2 T3 T4
1 0 0.32±0.15ab 1.3±0.25 a 3.32±0.43ab 4.8±0.35 b
2 10 0.14±0.14ab 0.66±0.29ab 1.74±0.25bc 5.54±0.41ab
3 20 -0.17±0.13b 0.38±0.18 b 1.4±0.26 c 3.81±0.3 b 4 DC 0.23±0.08a 1.5±0.44 a 3.69±0.98 a 7.2±0.96 a Dòng thí nghiệm 44 NT Nước dừa(%) T1 T2 T3 T4 1 0 -0.22±0.1 b 0.02±0.15 b 0.29±0.33 b 2.4±0.21b 2 10 0.15±0.13 a 1.13±0.23 a 2.9±0.43 a 4.4±0.5 a 3 20 0.14±0.13 ab 1.14±0.46a 2.42±0.11a 3±0.66 ab 4 DC -0.13±0.07 ab 0.46±0.13 ab 1.41±0.3 ab 3.31±0.33 ab Dòng thí nghiệm 54 NT Nước dừa (%) T1 T2 T3 T4 1 0 0.32±0.08 a 0.66±0.28 a 2.67±0.87 a 2.64±0.72 b 2 10 0.15±0.16 a 1.35±0.44 a 3.97±0.69 a 7.38±1.56 a 3 20 0.27±0.09 a 1.22±0.15 a 3.41±0.37 a 5.54±0.52ab 4 DC 0.11±0.12 a 1.4±0.25 a 3.77±0.73 a 6.01±1.16 a
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 T3 T4 t w 0 10 20 DC Dòng 31 -1 0 1 2 3 4 5 T1 T2 T3 T4 t w 0 10 20 DC Dòng 44 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 T3 T4 t w 0 10 20 DC Dòng 54
H.a: nước dừa 0% H.b: nước dừa 10%
H.c: nước dừa 20% H.d: NT đối chứng
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nước dừa đến sinh khối PEM (thước ngang: 2cm) Theo Trần Văn Minh (1999)[5], nước dừa có hoạt tính myo-inositol và một số acid amin khác.
Nhiều tác giả cho rằng, nước dừa được xác định là giàu chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996).
Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều cây. Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học các chất có hoạt tính trong nước dừa, nhưng sau sự khám phá cytokinin thì người ta chứng minh được nước dừa chứa zeatin (Letham, 1994) .[3]
Thí nghiệm cho thấy, khi bổ sung nước dừa 10% hoặc 20%, có thể thay thếđược BA 1,1mg/l vì không có sự khác biệt về hệ số tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) khi dùng nước dừa để thay thế BA 1,1mg/l. Hệ số tăng sinh giảm nếu không bổ sung BA 1,1mg/l và nước dừa.
Vai trò của BA trong sự phân chia tế bào của cây thông nhựa là không rõ ràng hoặc không có tác dụng đáng kể, bởi vì, khi sử dụng môi trường tăng sinh không có nước dừa và BA, khối tiền phôi (PEM) vẫn có sự phát triển. Tuy ảnh hưởng của BA đối với quá trình cảm ứng và tăng sinh khối tiền phôi (PEM) đã được chứng minh ở nhiều loài, tuy nhiên, với cây thông nhựa thì ảnh hưởng của BA có thể không cần thiết.
Một ghi nhận được là, thời gian suy thoái của khối tiền phôi khi nuôi cấy trong môi trường có nước dừa chậm hơn, khối phôi phát triển nhanh và mọc cao trên môi trường, khác với sự mọc lan và dẹt của khối tiền phôi trên môi trường không có nước dừa và BA 1,1mg/l (Hình 3.5)
3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của Glutamin đến các biến đổi hình thái và giai
đoạn nhân nhanh khối sinh phôi (Proliferation)
Sử dụng môi trường MLV và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D (2,2mg/l); BA (1,1mg/l). Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ Glutamin khác nhau đến sự tăng sinh khối thể phát sinh phôi được thể hiện trên bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng glutamin đến tăng sinh khối PEM (Ghi chú: (T1,T2, T3, T4 là tuần 1,2,3,4)
Dòng thí nghiệm 31 NT Glutamine (mg/l) T1 T2 T3 T4 1 0 0.02±0.04 a 0.53±0.12 b 1.34±0.13 b 2.73±0.21 b 2 100 0.11±0.03 a 0.9±0.1 b 2.09±0.17ab 3.64±0.27 b 3 300 0.58±0.29 a 1.8±0.4 ab 4.84±0.92 a 5.24±0.84ab 4 500 0.57±0.14 a 1.43±0.47ab 3.55±1.04ab 5.9±1.45 ab 5 700 0.36±0.11 a 3.05±2.13 a 4.83±2.01 a 8.44±3.45 a Dòng thí nghiệm 44 NT Glutamine (mg/l) T1 T2 T3 T4 1 0 0.08±0.07 a 0.73±0.32 a 2.15±0.79 a 3.48±0.69 c 2 100 0.95±0.79 a 1.62±0.45 a 3.3±0.91 a 6.78±1.01 a 3 300 0.57±0.29 a 1.12±0.43 a 2.38±0.69 a 4.79±1.06abc 4 500 0.09±0.17 a 2.92±1.33 a 3.06±0.84 a 6.02±0.55ab 5 700 0.36±0.26 a 1.24±0.53 a 2.35±0.71 a 4.04±0.42bc Dòng thí nghiệm 54 NT Glutamine (mg/l) T1 T2 T3 T4 1 0 -0.04±0.1 a 0.39±0.05 a 0.89±0.33 b 1.51±0.31 b 2 100 0.21±0.02 a 1.1±0.14 a 2.4±0.33 ab 5.27±0.75 a 3 300 0.33±0.2 a 0.79±0.17 a 1.7±0.52 ab 3.45±0.7 ab 4 500 0.10±0.11 a 1.36±0.23 a 3.6±0.68 a 5.81±1.07 a 5 700 0.16±0.06 a 0.96±0.23 a 2.03±.51 ab 4.38±0.55ab
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 w T1 T2 T3 T4 t 0 100 300 500 700 0 1 2 3 4 5 6 7 w T1 T2 T3 T4