2.5.1 Môi trường cảm ứng:
Sử dụng môi trường MLV (Litvay medium 1985); DCR (Gupta &
Durzan,1985); TE (Tang,1998) cho việc cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM). Môi trường được bổ sung thêm các thành phần như casein hydrolysate 1g/l, phytagel 4g/l , Sucrose 3%, Myo-inositol 1g/l, L-Glutamine 500mg/l. Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 2,2 mg/l, 6-benzyladenine (BA) 1,1mg/l cho cảm ứng tạo khối phát sinh phôi. [18][21]
2.5.2 Môi trường duy trì và tăng sinh khối:
Môi trường duy trì và tăng sinh khôí có thành phần giống như môi trường cảm
ứng.
Tiến hành thay đổi để khảo sát ảnh hưởng của Glutamin (0, 100, 300, 500, 700), nước dừa (0%, 10%, 20%) và loại đường maltose (10%, 20%, 30%), sucrose (10%, 20%, 30%) đến sự tăng sinh khối của khối tiền phôi (PEM). [21]
2.5.3 Môi trường trưởng thành:
Sử dụng môi trường MLV bổ sung casein hydrolysate (1g/l); glutamine (500mg/l), sucrose (50g/l); phytagel (6g/l), PEG-polyethylene glycol 8000 (2%.) Có sự thay đổi khi loại bỏ auxin, cytokinin thay vào đó là bổ sung ABA.
Khảo sát ảnh hưởng của ABA (0, 40, 60, 80, 100μM) đến thời gian, số lượng và sự hình thành phôi trưởng thành.[21]
2.6 Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại trên số lượng mẫu
đảm bảo tính thống kê.
2.7 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu:
• Theo dõi tỉ lệ cảm ứng tạo phát sinh khối tiền phôi (PEM):
Xác định tỉ lệ % sự hình thành thể phát sinh phôi = (số lượng PEM tạo thành x 100%)/số lượng mẫu câý.
• Theo dõi sự sinh trưởng của khối tiền phôi (PEM):
Xác định sự tăng sinh khối trên môi trường đặc bằng cách cân trọng lượng sinh khối trước và sau khi tăng sinh. Từđó tính hệ số tăng sinh khối.
Hệ số tăng sinh khối = trọng lượng sinh khối sau khi nuôi cấy (g) : trọng lượng sinh khối trước khi nuôi cấy (g)
• Thời gian tạo phát sinh phôi:
Theo dõi thời gian tạo thể tiền phôi, tạo lá mầm.
• Tỉ lệ tạo phôi thành thục
• Hình thái, giai đoạn phát triển của quá trình tạo phôi soma
Phân tích kết quả: số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm SPSS 11.5
Nơi thực hiện đề tài: Phân viện nghiên cứu khoa học lâm nghiệp Miền Nam
CHƯƠNG III
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM-proembryo mass): khối tiền phôi (PEM-proembryo mass):
Tiến hành khảo sát 3 dòng thông nhựa (31, 44, 54) trên 3 môi trường MLV, DCR và TE. Thành phần môi trường cơ bản bổ sung Casein Hydrolysate (1g/l), myo- inositol (1g/l); Glutamine (500mg/l), Sucrose (30g/l); Phytagel (4g/l).
Theo dõi tỉ lệ cảm ứng tạo khối tiền phôi (PEM) sau 6-8 tuần. Kết quả thí nghiệm như
sau:
Bảng 3.1: Tỉ lệ phát sinh phôi trên môi trường MLV, DCR, TE
Dòng Môi trường Tổng số mẫu cấy (%) Tỉ lệ phát sinh phôi (%) Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ chết 54
MLV 251 20.79±3.8a 3.93±3.26a 8.55±2.9a
DCR 235 11.54±2.62b 8.11±4.68a 13.7±4.05a
TE 204 10.23±2.83b 9.32±5.44a 9.97±3.09a 31
MLV 412 12.24 ±2.28a 19.95 ± 5.4ab 13.86±4.41a
DCR 357 11.57 ±2.07a 8.59 ±2.71a 17.13±4.73a
TE 396 9.92 ±1.15b 34.38±6.38bc 16.36±4.3a
44 MLV 251 17.92±3.6a 22.55±6.65a 21.54±6.8a
DCR 210 5.94±2.2b 12.81±6.76a 35.88±8ab TE 240 8.91±3.42ab 23.56±7.1a 45.11±8.65b
Hình 3.1 : Sự khởi tạo PEM trên môi trường cảm ứng (Thước ngang: 1cm) Kết quả trên cho thấy rằng, môi trường MLV cho hiêụ quả tạo thể phát sinh phôi cao nhất trên tất cả các dòng.
Tuy nhiên, môi trường DCR và TE cũng cho hiêụ quả tương đương với dòng 44 và 54. Từ kết quảđó, môi trường MLV được sử dụng để tiếp tục khảo sát quá trình duy trì và tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trong quá trình cảm ứng, cũng ghi nhận được một số dạng khối tiền phôi, mà theo một số thí nghiệm trước đó đã chứng minh ảnh hưởng khác nhau của mỗi dạng đến quá trình tạo phôi soma.
Tiến hành quan sát cấu trúc của khối tiền phôi (PEM), nhận thấy có 2 dạng cấu trúc:
• Dạng A: khối tiền phôi vàng đục, rắn chắc, cấu trúc tương tự như tế bào mô sẹo, gồm rất nhiều tế bào hình cầu gắn kết chặt chẽ với nhau.
• Dạng B: khối tiền phôi trắng đục, mềm, rời rạc, hơi nhầy. Nhuộm và quan sát dưới vật kính 10X, thấy rằng trong khối tiền phôi này, gồm nhiều cấu trúc phân cực. Cực thứ nhất bao gồm nhiều tế bào tròn, tế bào chất đậm đặc bắt màu mạnh với thuốc nhuộm acetocarmine 5%. Cực thứ 2 bào gồm nhiều tế bào dài, hình liềm với tế bào chất rời rạc, không bao lớn.
Dạng A 10X (A) 20X (A)
Dạng B 10X (B) 20X (B)
3.2 Cấu trúc hình thái trong quá trình cảm ứng tạo thể phát sinh phôi PEM:
H.a H.b
H.c H.d
H.e H.f
Sau 4-8 tuần đặt trên môi trường cảm ứng, khối tiền phôi (PEM) đã được hình thành (H.a) với cấu trúc trắng đục, nhầy, phát triển lan trên môi trường.
Tiến hình giải phẫu quan sát, thấy rằng các tế bào trong khối tiền phôi (PEM) trải qua một chuỗi trình tự phân chia theo thời gian để từ một tế bào ban đầu phân chia thành cấu trúc lưỡng cực (H.b) với 2 loại tế bào: tế bào tròn với tế bào chất đậm đặc bắt màu tốt với Acetone carmin 5% và tế bào dài hoặc ovan có không bào lớn.
Hai loại tế bào này trải qua quá trình phân bào và phân chia để tăng số lượng (Hình c) tạo thành cấu trúc khối tiền phôi (PEM) II (Hình d).
Cấu trúc khối tiền phôi (PEM) II tiếp tục phân chia, phát triển thành khối tiền phôi (PEM) III và đi vào con đường biệt hóa để tạo thành cấu trúc phôi soma ở pha sớm (Hình e,f).
Kết quả này tương tự như những quan sát của Filonova và ctv.,1999 khi tiến hành khảo sát các giai đoạn phát triển của Picea abies bằng phương pháp time lapse tracking [15].
3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh (Proliferation) khối tiền phôi: nhanh (Proliferation) khối tiền phôi:
Vai trò của nước dừa đến quá trình phát sinh phôi soma đã được chứng minh ở
nhiều loài thực vật 2 lá mầm. Tuy nhiên, đối với họ thông thì những nghiên cứu này còn rất mới mẻ.
Kết quả theo dõi sự tăng sinh khối tiền phôi (PEM) sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần nuôi cấy được thể hiện trên bảng 3.2.
Sau 1 tháng nuôi cấy, khối tiền phôi (PEM) phát triển tăng trọng lượng. Ở dòng 31 (nghiệm thức 3) và 44 (nghiệm thức 1 và 4) ở tuần đầu tiên nhận thấy có sự giảm trọng lượng mẫu cấy, điều này có thể là do một số tế bào khối tiền phôi (PEM) chưa kịp thích nghi với môi trường mới nên chết đi. Tuy nhiên, sau đó, các tế bào còn lại kịp thích nghi và phát triển tăng trọng lượng.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng nước dừa đến sự tăng sinh khối tiền phôi (PEM)
Dòng thí nghiệm 31
NT Nước dừa (%) T1 T2 T3 T4
1 0 0.32±0.15ab 1.3±0.25 a 3.32±0.43ab 4.8±0.35 b
2 10 0.14±0.14ab 0.66±0.29ab 1.74±0.25bc 5.54±0.41ab
3 20 -0.17±0.13b 0.38±0.18 b 1.4±0.26 c 3.81±0.3 b 4 DC 0.23±0.08a 1.5±0.44 a 3.69±0.98 a 7.2±0.96 a Dòng thí nghiệm 44 NT Nước dừa(%) T1 T2 T3 T4 1 0 -0.22±0.1 b 0.02±0.15 b 0.29±0.33 b 2.4±0.21b 2 10 0.15±0.13 a 1.13±0.23 a 2.9±0.43 a 4.4±0.5 a 3 20 0.14±0.13 ab 1.14±0.46a 2.42±0.11a 3±0.66 ab 4 DC -0.13±0.07 ab 0.46±0.13 ab 1.41±0.3 ab 3.31±0.33 ab Dòng thí nghiệm 54 NT Nước dừa (%) T1 T2 T3 T4 1 0 0.32±0.08 a 0.66±0.28 a 2.67±0.87 a 2.64±0.72 b 2 10 0.15±0.16 a 1.35±0.44 a 3.97±0.69 a 7.38±1.56 a 3 20 0.27±0.09 a 1.22±0.15 a 3.41±0.37 a 5.54±0.52ab 4 DC 0.11±0.12 a 1.4±0.25 a 3.77±0.73 a 6.01±1.16 a
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 T3 T4 t w 0 10 20 DC Dòng 31 -1 0 1 2 3 4 5 T1 T2 T3 T4 t w 0 10 20 DC Dòng 44 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 T3 T4 t w 0 10 20 DC Dòng 54
H.a: nước dừa 0% H.b: nước dừa 10%
H.c: nước dừa 20% H.d: NT đối chứng
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nước dừa đến sinh khối PEM (thước ngang: 2cm) Theo Trần Văn Minh (1999)[5], nước dừa có hoạt tính myo-inositol và một số acid amin khác.
Nhiều tác giả cho rằng, nước dừa được xác định là giàu chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996).
Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều cây. Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học các chất có hoạt tính trong nước dừa, nhưng sau sự khám phá cytokinin thì người ta chứng minh được nước dừa chứa zeatin (Letham, 1994) .[3]
Thí nghiệm cho thấy, khi bổ sung nước dừa 10% hoặc 20%, có thể thay thếđược BA 1,1mg/l vì không có sự khác biệt về hệ số tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) khi dùng nước dừa để thay thế BA 1,1mg/l. Hệ số tăng sinh giảm nếu không bổ sung BA 1,1mg/l và nước dừa.
Vai trò của BA trong sự phân chia tế bào của cây thông nhựa là không rõ ràng hoặc không có tác dụng đáng kể, bởi vì, khi sử dụng môi trường tăng sinh không có nước dừa và BA, khối tiền phôi (PEM) vẫn có sự phát triển. Tuy ảnh hưởng của BA đối với quá trình cảm ứng và tăng sinh khối tiền phôi (PEM) đã được chứng minh ở nhiều loài, tuy nhiên, với cây thông nhựa thì ảnh hưởng của BA có thể không cần thiết.
Một ghi nhận được là, thời gian suy thoái của khối tiền phôi khi nuôi cấy trong môi trường có nước dừa chậm hơn, khối phôi phát triển nhanh và mọc cao trên môi trường, khác với sự mọc lan và dẹt của khối tiền phôi trên môi trường không có nước dừa và BA 1,1mg/l (Hình 3.5)
3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của Glutamin đến các biến đổi hình thái và giai
đoạn nhân nhanh khối sinh phôi (Proliferation)
Sử dụng môi trường MLV và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D (2,2mg/l); BA (1,1mg/l). Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ Glutamin khác nhau đến sự tăng sinh khối thể phát sinh phôi được thể hiện trên bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng glutamin đến tăng sinh khối PEM (Ghi chú: (T1,T2, T3, T4 là tuần 1,2,3,4)
Dòng thí nghiệm 31 NT Glutamine (mg/l) T1 T2 T3 T4 1 0 0.02±0.04 a 0.53±0.12 b 1.34±0.13 b 2.73±0.21 b 2 100 0.11±0.03 a 0.9±0.1 b 2.09±0.17ab 3.64±0.27 b 3 300 0.58±0.29 a 1.8±0.4 ab 4.84±0.92 a 5.24±0.84ab 4 500 0.57±0.14 a 1.43±0.47ab 3.55±1.04ab 5.9±1.45 ab 5 700 0.36±0.11 a 3.05±2.13 a 4.83±2.01 a 8.44±3.45 a Dòng thí nghiệm 44 NT Glutamine (mg/l) T1 T2 T3 T4 1 0 0.08±0.07 a 0.73±0.32 a 2.15±0.79 a 3.48±0.69 c 2 100 0.95±0.79 a 1.62±0.45 a 3.3±0.91 a 6.78±1.01 a 3 300 0.57±0.29 a 1.12±0.43 a 2.38±0.69 a 4.79±1.06abc 4 500 0.09±0.17 a 2.92±1.33 a 3.06±0.84 a 6.02±0.55ab 5 700 0.36±0.26 a 1.24±0.53 a 2.35±0.71 a 4.04±0.42bc Dòng thí nghiệm 54 NT Glutamine (mg/l) T1 T2 T3 T4 1 0 -0.04±0.1 a 0.39±0.05 a 0.89±0.33 b 1.51±0.31 b 2 100 0.21±0.02 a 1.1±0.14 a 2.4±0.33 ab 5.27±0.75 a 3 300 0.33±0.2 a 0.79±0.17 a 1.7±0.52 ab 3.45±0.7 ab 4 500 0.10±0.11 a 1.36±0.23 a 3.6±0.68 a 5.81±1.07 a 5 700 0.16±0.06 a 0.96±0.23 a 2.03±.51 ab 4.38±0.55ab
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 w T1 T2 T3 T4 t 0 100 300 500 700 0 1 2 3 4 5 6 7 w T1 T2 T3 T4 t 0 100 300 500 700 -1 0 1 2 3 4 5 6 w T1 T2 T3 T4 t 0 100 300 500 700
Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng glutamin đến tăng sinh khối PEM Dòng 31
Dòng 44
Glu 0 Glu 100
Glu 300 Glu 500
Glu 700
Các mô nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp nên các acid amin thiết yếu cần thiết cho quá trình trao đổi chất khác nhau. Mặc dù thế, việc bổ sung các amino acid vào môi trường vẫn rất cần thiết để kích thích sinh trưởng tế bào và hình thành các dòng tế
bào. Không giống với các Nitơ vô cơ, Nitơ hữu cơ (glutamin, casein hydrolysate, asparagine và adenin) được các tế bào thực vật hấp thu nhanh hơn.
Glutamin có vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng sinh phôi và tăng sinh khối tiền phôi. Glutamin là nguồn acid amin thiết yếu cung cấp cho quá trình tổng hợp protein và các hoạt động biến dưỡng. Các thí nghiệm khảo sát cho thấy rằng, vai trò của glutamin là rất cần thiết.
Trên môi trường không có Glutamin, khối tiền phôi phát triển rất chậm và nhanh chóng bị thoái hóa, khối tiền phôi có màu nâu, tơi xốp.
Sử dụng glutamin ở nồng độ 300-500 (mg/l) cho kết quả tốt nhất trên cả 3 dòng thí nghiệm.
3.5 Thí nghiệm: Ảnh hưởng của đường maltose và sucrose lên sự tăng sinh khối của PEM: khối của PEM:
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của loại đường đến quá trình tăng sinh khối PEM
Dòng thí nghiệm 44
NT Đường (g/l) Sau 1 tháng nuôi cấy
1 Sucrose 10 3.29±0.47 cd 2 Sucrose 20 6.02±0.55 ab 3 Suerose 30 2.96±0.13d 4 Maltose 10 6.43±0.68 a 5 Maltose 20 7.11±0.59 a 6 Maltose 30 4.72±0.42 bc
Xin Y Lin và ctv., 1998 đã chứng minh vai trò của maltose khi thay thế sucrose trong quá trình trưởng thành của phôi và nhận thấy có sự khác biệt đáng kể [18]. Tuy nhiên, chưa có thí nghiệm dùng maltose để thay thế sucrose dùng trong quá trình cảm
ứng và tăng sinh khối tiền phôi.
Thí nghiệm cho thấy, có thể sử dụng một trong 2 nguồn đường này làm nguồn cacbon hydrat (Cacbon) cung cấp cho quá trình biến dưỡng.
Sử dụng sucrose 20% cho kết quả tốt hơn so với sucrose 10% và 30%.Việc dùng maltose thay thế sucrose cũng cho hiệu quả tương tự, mặc dù sử dụng maltose 10% cũng đã tạo được hệ số tăng sinh rất tốt. 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Suc 10 Suc 20 Suc 30 Mal 10 Mal 20 Mal 30
Đồ thị 3.3 Ảnh hường của đường đến quá trình tăng sinh PEM
Như vậy, khi tăng nồng độ cacbon hydrat (sucrose và maltose), hệ số tăng sinh tăng. Tuy nhiên, khi tăng lượng cacbon hydrat này quá cao, sẽ làm giảm hệ số tăng sinh. Điều này có thể do cacbon hydrat cao làm tăng áp suất thẩm thấu, ảnh hưởng đến các hoạt động biến dưỡng làm ức chế khả năng phát triển của tế bào.
3.6 Quan sát cấu trúc hình thái của khối phát sinh phôi trong quá trình phát triển: triển:
H.a (thanh ngang: 0,5cm) H.b (thanh ngang: 2cm)
H.c (thanh ngang: 1,5mm) H.d (thanh ngang: 2mm)
Hình 3.7: Hình thái phát triển khối PEM trong quá trình tăng sinh
Tiến hình nhuộm quan sát cấu trúc khối tiền phôi trong suốt quá trinh tăng sinh, nhận thấy rằng sự hình thành các phôi ở giai đọan sớm đã được hình thành từ rất sớm (Hình c, mũi tên) và với số lượng khá nhiều. Quan sát dưới kính lúp cũng có thể thấy được cấu trúc của phôi sớm trên môi trường tăng sinh (Hình d, mũi tên). Theo dõi các cấu trúc phôi này, nhận thấy rằng chúng không thể biệt hóa thành phôi trưởng thành nếu
không đặt vào môi trường thành thục hóa, các phôi này sẽ chết đi. Điều này đã được ghi nhận bởi Dương Tấn Nhựt, 2007 [6], Filonova, 2002 [15].
3.7 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến cấu trúc hình thái và tỷ lệ tạo phôi thành thục hóa: thục hóa:
Sử dụng môi trường MLV bổ sung casein hydrolysate (1g/l); glutamine (500mg/l), sucrose (50g/l); phytagel (6g/l), PEG (polyethylene glycol 8000) 2% và khảo sát ảnh hưởng của Acid abscisic (0,40,60,80) đến sự trưởng thành của phôi.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng ABA đến tỷ lệ tạo phôi trưởng thành
Dòng ABA (μM)
Tỷ lệ tạo phôi Giai đoạn lá mầm/ 1g PEM 31 0 0.0±0.0d 40 4.33±0.66c 60 6.33±0.33b 80 8.66±0.33a 100 5.66±0.66bc 44 0 0.0±0.0b 40 2.33±0.33ab 60 6±2.08a 80 4.66±1.45ab 100 2±2ab 54 0 0.0±0.0d 40 1.66±0.88cd 60 5±0.57ab 80 7.33±0.66a 100 3±1.52bc
Như vậy, ABA có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành phôi trưởng thành. Bổ
sung ABA nồng độ 60-80µM cho kết quả tốt cho quá trình trưởng thành của phôi. Theo (Black, 1991) và (Kong và ctv, 1997), nồng độ ABA nội sinh có sự thay đổi suốt quá trình phát triển của hạt ở cây có hoa và thực vật hạt trần. Điển hình là nồng độ
ABA nội sinh ở mức thấp ở giai đoạn cảm ứng tạo phôi, tăng trong giai đoạn phôi phát triển và giảm ở giai đoạn phôi trưởng thành.
Lượng ABA nội sinh được tích trữ chủ yếu trong megagametophyte. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, khi tiến hành nuôi cấy phôi soma cũng phải đáp ứng lượng ABA ngoại sinh tương tự, tuy nhiên, điều này còn tùy thuộc loài và kiểu gen.
Nồng độ ABA ngoại sinh 40µM cần thiết cho sự phát triển bình thường của phôi và ức