Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng 15: các chủng S. suis 2 phân lập từ bệnh nhân, giếng 16: chứng dương (+) là chủng S. suis 31533 với mrp1148, giếng 16: chứng dương (+) là chủng S. suis 89-1591 với mrp1556, giếng 17: chứng âm (−) là nước, M: thang 100 bp DNA. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%.
Kết quả nghiên cứu cho thấy 90,72% (88/97) chủng mang gen mrp (1148 bp), 2,06% (2/97) chủng mang gen mrpS (740 bp) và 7,21% (7/97) chủng mang gen
mrp với kích thước ~1100 bp. Trong đó, gen mrp1100 là một biến thể mới. Gen mrpS
chỉ hiện diện trong các chủng phân lập từ bệnh nhân, không thấy hiện diện trong các chủng phân lập từ heo. Ở đây, tôi không khảo sát sự biểu hiện protein của gen mrp
nhưng theo tác giả Silva, những chủng dương tính với mrpS và mrp biểu hiện MRP với các trọng lượng phân tử lần lượt là 120 kDa và 136 kDa [46].
3.3.3. So sánh trình tự của hai biến thể epf mới với epf626
Kết quả giải trình tự epf với kích thước khoảng 400 bp và 800 bp, tôi đã xác định được kích thước thật của chúng lần lượt là 399 bp và 798 bp (Phụ lục 4 và 5). Sau đó, tôi tiến hành sắp gióng cột trình tự gen epf 626 với epf 399 và epf 798 (Hình 3.8).
Hình 3.8: So sánh trình tự giữa các gen epf 798, epf 626 và epf 399 với nhau. (R1, R2, R3 là các đoạn lặp)
Cả hai biến thể epf 798 và epf 399 đều được phân lập từ bệnh nhân. Gen epf798
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng đoạn khoảng 227 bp so với epf (đoạn R2). Các gen epf 798, epf 626 và epf 399 đều có chứa đoạn R3.
Sự tương đồng gen epf với gen epf* (những gen epf có kích thước lớn) cho thấy rằng những gen này có nguồn gốc từ gen khác hoặc chúng có cùng một tổ tiên. Sự thay đổi về số đoạn lặp lại trong những gen này là kết quả của quá trình nhân đôi hoặc mất đi một phần nào đó trình tự gen. Sự vắng mặt những trình tự lặp lại liên quan đến tính độc lực, những chủng S. suis độc lực yếu có thể trở thành những chủng gây bệnh [48]. Những chủng mang gen epf có liên quan đến di chứng điếc ở những bệnh nhân cao hơn so với những chủng mang gen epf* [35]. Di chứng điếc này cao hơn các trường hợp viêm màng não khác cũng do vi khuẩn gây ra và có thể chiếm tới 50% ở châu Âu và 65% ở châu Á [20].
3.3.4. Hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR
Đa số các chủng S. suis phân lập từ bệnh nhân của hai trận dịch lớn xảy ra ở Trung Quốc đều có sự hiện diện của gen salKR. Mặt khác, gen này không hiện diện trong những chủng phân lập tại những nước khác. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này tôi đã tiến hành khảo sát sự hiện diện của gen salKR trong các chủng phân lập tại Việt Nam (Hình 3.9).
100 (16S rRNA) 300 300 500 700 1500 bp salKR
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng Hình 3.9: Khảo sát sự hiện diện của hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR. Giếng 1 – 16: các chủng S. suis 2 trong nghiên cứu, giếng 17: chứng dương (+) là chủng S. suis 2 BM411, giếng 18: chứng âm (−) là chủng S. suis BM407, giếng 19: chứng âm (−) là nước, M: thang 100 bp DNA. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%.
Kết quả nghiên cứu cho thấy 81 (83,51%) chủng chứa gen salKR. Trong đó, số chủng dương tính với salKR chiếm 76,47% (13/17) chủng phân lập từ heo bệnh, 95,45% (21/22) chủng phân lập từ heo khỏe và 81,03% (47/58) chủng phân lập từ bệnh nhân.
Đồng thời, tôi cũng tiến hành khảo sát sự hiện diện promoter salKR (mồi salKR-pro-R được thiết kế dựa theo những chủng phân lập tại Trung Quốc) với kích thước sản phẩm là 806 bp. Tôi chỉ khuếch đại được 22 (27,16%) chủng trong số 81 chủng dương tính với gen salKR.
Sau đó, tôi sử dụng một mồi ngược khác (mồi salKR-P2 được thiết kế dựa theo chủng S. suis phân lập tại Việt Nam) để khảo sát sự hiện diện promoter salKR
với kích thước sản phẩm là 856 bp. Kết quả cho thấy tất cả chủng âm tính với mồi salKR-pro-R đều cho kết quả dương tính với mồi salKR-P2 (59 chủng, 72,84%).
Theo nghiên cứu của TS. Ngô Thị Hoa, trình tự gen của chủng dương tính đối với mồi salKR-P2 (Việt Nam) mất một đoạn gen khoảng 5 kb so với chủng dương tính với mồi salKR-pro-R (Trung Quốc) (kết quả chưa công bố). Như vậy, khoảng 72,84% chủng S. suis phân lập tại Việt Nam mang gen salKR đều mất một đoạn gen khoảng 5 kb.
3.3.5. Tổ hợp về các gen độc lực của chủng S. suis 2
Khoảng 50,52% chủng S. suis 2 phân lập tại Việt Nam có kiểu gen
cps2J+sly+epf+mrp+salKRproVN, kế đến là kiểu gen cps2J+sly+epf+mrp+salKRproTQ (17,53%). Cả hai kiểu gen này đều hiện diện trong các chủng S. suis 2 phân lập từ
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng bệnh nhân và heo. Tất cả kiểu gen hiện diện trong các chủng phân lập từ heo bệnh thì cũng hiện diện trong các chủng phân lập từ bệnh nhân (kiểu gen thứ 3 và 4 trong Bảng 3.3). Mặt khác, một vài kiểu gen chỉ hiện diện ở heo khỏe nhưng không thấy hiện diện ở bệnh nhân và ngược lại. Do đó, tôi đề nghị rằng chủng phân lập từ heo bệnh có nguy cơ lây nhiễm sang người cao hơn chủng phân lập từ heo khỏe.
Bảng 3.3: Tổ hợp về các gen độc lực của 97 chủng S. suis 2
Tổ hợp về các gen độc lực Heo khỏe Heo bệnh Bệnh nhân Tổng (%)
1) cps2J+sly+epf+mrp+salKRproVN 5 10 34 49 (50,52) 2) cps2J+sly+epf+mrp+salKRproTQ 11 2 4 17 (17,53)
3) cps2J+sly+epf+mrp+salKR− 4 9 13 (13,40)
4) cps2J+sly+epf+mrp1100salKRproVN 1 6 7 (7,22)
5) cps2J+sly−epf−mrp+salKRproTQ 5 5 (5,15)
6) cps2J+sly+epf+mrp747salKRproVN 2 2 (2,06) 7) cps2J+sly+epf 399mrp+salKRproVN 1 1 (1,03)
8) cps2J+sly+epf 798mrp+salKR− 1 1 (1,03) 9) cps2J+sly+epf-mrp+salKR− 1 1 (1,03)
10) cps2J+sly−epf−mrp+salKR− 1 1 (1,03)
(Ghi chú: proTQ: các chủng S. suis có promoter SalKR giống chủng S. suis Trung Quốc, proVN: các chủng S. suis có promoter SalKR giống chủng S. suis Việt Nam.)
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng