2. Vật liệu và phương pháp 1.Đối tượng nghiên cứu
2.3.3.Phương pháp multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction)
Tôi khảo sát sự hiện diện của những gen kháng kháng sinh và những gen liên quan đến độc lực của S. suis 2 bằng phương pháp multiplex PCR.
Nguyên tắc PCR
PCR là phương pháp khuếch đại trình tự gen nhờ hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn của enzym DNA polymerase với sự hiện diện của mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với trình tự gen đó.
PCR gồm các bước chính:
- Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 940C – 950C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính.
- Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C – 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai.
- Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian kéo dài tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại. Đây là giai đoạn tổng hợp.
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng Một chu kì bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếc đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kì sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu.
Hóa chất dùng trong PCR
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: NH4 reaction buffer 10X (Bioline) dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Roche)
MgCl2 (Bioline)
Taq DNApolymerase (Bioline) Agarose (Bio Rad)
Ethidium bromide (10 mg/ml)
Thang 100 bp DNA và thang 1 kb plus DNA (Invitrogen)
Dung dịch TBE 1X dùng để pha gel agarose và chạy điện di có thành phần:
Tris 10,8 g Acid boric 55 g EDTA 0,5M 40 ml Dung dịch nạp mẫu 6X có thành phần: Orange G 0,25% (w/v) Glycerol 30% (v/v) Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong PCR - PCR 8-strip - Máy PCR (Eppendorf) - Lò vi sóng
- Bồn điện di (Bio Rad)
Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng