tích hợp (Integrated Amperometric Detection)
Những năm 1980 và 1990, phương pháp phát hiện điện hóa học đã được chấp nhận như là một lựa chọn cho những hợp chất sinh học quan trọn. Ngày nay, hầu hết các phòng xét nghiệm trên thế giới vẫn dựa vào kỹ thuật điện hóa học khi phân tích các loại catecholamin trong dịch sinh học. Mặc dù phương pháp đó đã có thành công đáng kể, song cải tiến quan trọng tiếp theo đến từ phương pháp phát hiện xung dòng điện. Sự ra đời của xung điện đã mở rộng phạm vi của phương pháp phát hiện điện hóa học thông qua việc phục hồi điện cực đúng lúc cho mỗi lần đ.
Phân tích acid amin dựa trên sắc ký trao đổi ion kết hợp phương pháp phát hiện xung dòng điện tích hợp (Integrated Pulsed Amperometric Detection- IPAD) được phát triển từ phương pháp của Polta và Johnson năm 1983. Hệ thống HPLC đầu tiên dựa trên phương pháp đó được giới thiệu năm 1999. HPLC có vai trò tách các acid amin phân tích nhờ nguyên lý của sắc ký lỏng. Sau đó việc phát hiện và định lượng nồng độ các acid amin dựa vào phương pháp IPAD. Cải tiến quan trọng nhất của IPAD là nó không cần phải dẫn xuất bất cứ acid amin nào để phát hiện ra chúng.
Hình . : ệ thống IPA
Gold: điện cực làm việc. Ag/AgCl: điện cực tham chiế
Eluent in/out: dung môi rửa dải đi vào/đi r
Pt: dây dẫn plati
Glass membrance: màng thủy tinh của điện cực tham chiế
Counterelectrode: phản điện cực-điện cực bằng vàn
1.2. .3. Sắc ký khí mao quản trong phân tích protein và các acid ami
Sắc ký khí được ứng dụng rộng rãi trong phân tích acid amin vì những ưu điểm vốn có của nó là khả năng phân tích cao, độ nhạy cao, đơn giản, chi phí thấp. Tuy nhiên, vấn đề tồn tại chính là sự cần thiết phải dẫn xuất các acid amin thành những hợp chất dễ bay hơi và ít phân cực hơn. Vì vậy, không chỉ sự phát triển của hệ thống sắc ký khí, mà sự phát triển đi kèm của chất dẫn xuất đã trở thành những yếu tố quan trọng để đạt được kết quả mong muốn trong phân tích sắc ký khí. Có rất nhiều phương pháp chuẩn bị để tạo dẫn xuất bay hơi trong phân tích định lượng protein và acid amin phi protein
Các loại N-perfluoroacyl alkyl esters được nghiên cứu rộng rãi, một số được sử dụng trong thực hành mang lại kết quả thành công trong định lượng acid amin ở các mẫu sinh học. Tuy nhiên, gần đây người ta đã chỉ ra rằng một vài trong số các chất dẫn xuất này có những thuộc tính không thỏa mãn cho quá
trình dẫn xuất như đòi hỏi điều kiện khan, nhiệt độ phản ứng cao, giáng hóa thành các amid (glutamine và asparagine) khi được xúc tác bởi HCl và độ hòa tan thấp của một vài loại acid amin trong môi trường có nồng độ rượu cao. Hơn nữa, những chất dẫn xuất này tạo ra nhiều đỉnh đối với một vài loại acid amin, và một vài chất dẫn xuất có nhiệt độ sôi cao hơn có xu hướng phân hủy trên cột mao quản dài.
Gần đây, một phương pháp khác sử dụng chất dẫn xuất khác là ethyl chloroformate (ECF) được giới thiệu. Mặc dù phương pháp này thì đơn giản hơn và nhanh hơn bởi phản ứng từng bước trong nước-ethanol-pyridine và mang lại độ phân giải cao trên cột mao quản, nhưng nó lại không có tính chọn lọc đối với acid amin vì ECF cũng phản ứng với c c chất khác như acid béo, amin và các acid hữu cơ khác trong cùng một điều kiện phản ứng. Đồng thời dẫn xuất của arginine không thu được.
Một phương pháp khác sử dụng mao quản và kỹ thuật tạo sóng siêu âm cũng được miêu tả gần đây với thành tựu về tốc độ và tính đơn giản. Đây là phương pháp nhanh và đơn giản để phát hiện các acid amin cấu tạo protein dựa trên sự tạo thành các dẫn xuất N(O,S)-iso butoxycarbonyl methyl ester bằng cách sử dụng kỹ thuật tạo sóng siêu âm và sau đó phân tích sắc ký bằng phương pháp ion hóa ngọn lửa (flame ionization detection- FID). Sử dụng phương pháp FID-GC đã chứng minh được 22 loại acid amin của protein có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy và định tính với các đỉnh riêng rẽ trong vòng 9 phút. Hơn thế, acid amin của protein và 33 acid amin không cấu tạo protein có thể được phát hiện cùng nhau trong v ng 25 phú
1.2. .4. Đo nồng độ acid amin huyết tương t ong dịch siêu lọc bằng HPLC với dẫn xuất tiền cột tự động bằng O-phthaldialdehyddẫn xuất tiền cột tự động bằng O-phthaldialdehyddẫn xuất tiền cột tự động bằng O-phthaldialdehyd dẫn xuất tiền cột tự động bằng O-phthaldialdehyd
Trong gần 40 năm qua, việc phân tách acid amin đã được tiến hành chủ u nhờ vào các thiết bị phân tích bằng sắc ký trao đổi ion và phát hiện bằng dẫn xuất hậu cột. Sử dụng thiết bị này được ủng hộ rộng rãi trước đây, đặc biệt là với các ứng dụng thường quy vì độ tin cậy của nó. Tuy nhiên những thiết bị phân tích này tốn công sức, chi phí cao, tốn thời gian và thường được tiến hành trên những thiết bị chuyên biệt. Trong những năm gần đây, phương pháp sử dụng dẫn xuất tiền cột kết hợp với HPLC pha đảo đã thu được những thành công ban đầu và dần thay thế cho việc phân tích acid amin cổ điển. Trong sự so sánh với sắc ký trao đổi ion-dẫn xuất hậu cột, thì HPLC –dẫn xuất tiền cột có những ưu điểm như tiết kiệm thời gian, nâng cao độ nhạy và độ linh hoạt, chi phí thấp trong vật tư và bảo dưỡng.
Trong số các phương pháp dẫn xuất tiền cột, O-phthaldialdehyde (OPA) đã được dựng như hóa chất dẫn xuất phổ biến nhất. Với sự có mặt của hợp chất chứa nhóm thiol và trong môi trường kiềm, OPA phản ứng với các acid amin bậc một để hình thành nên dẫn xuất isoindole phát huỳnh quang mạnh. Quá trình tạo dẫn xuất tương đối dễ dàng và phản ứng diễn ra nhanh chóng ở nhiệt độ phòng trong dung dịch nước , không cần đến các thao tác tinh sạch tốn công sức. Dẫn xuất OPA kém phân cực hơn các acid amin bậc một và có thể tách chiết khỏi nhau dễ dàng nhờ HPLC pha đảo. Hơn thế, thuốc thử bản thân nó không phát huỳnh quang và do vậy không tạo ra các peak nhiễ
Kỹ thuật s êu ọc có những ưu điểm trong loại bỏ protein mà không ần dùng đến hóa chất, thêm vào đó còn giữ cho mẫu gần với trạng thái sinh lý nhất. Một lợi thế của siêu lọc nữa là tiểu cầu và bạch u được loại bỏ khỏi huyết tương, đồng thời sự nhiễm tạp của các acid amin từ các thành phần tế
bào máu này được loại b . Kỹ thuật siêu lọc đã được lựa chọn để chuẩn bị các mẫu không có protein trong phân tích acid amin bằng phương pháp HPLC với dẫn xuất tiền cột. Kết quả chỉ ra rằng dịch siêu lọc của huyết tương có thể thay thế việc loại bỏ protein bằng hóa chất trong phân tích HPLC đối với acid amin tự do.
1.2.5.5. Điện di mao quản trong phân tích 4-hydroxyproline và các acid amin khác amin khác amin khác amin khác
- hydroxyproline được tạo thành từ quá trình hydroxyl hóa proline bởi enzyme prolyl hydroxylase sau khi prl ine tham gia tổng hợp protein( thay đổi sau dịch mã). Phản ứng xảy ra trong lưới nội sinh chất. Mặc dù không trực tiếp hợp thành nên protein, hydroy proline chiếm khoảng 4% trong tổng số acid amin được tìm thấy trong mô cơ th
Hydroxyproline là thành phần chính của collagen, cùng với proline đóng vai trị then chốt trong tính ổn định của collagen. Chúng cho phép duy trì cấu trúc xoắn ốc sắc nét của collagen. Trong cấu tạo kinh điển của collagen, bộ ba Xaa-Yaa—Gly (Xaa và Yaa là các acid amin bất kỳ) , một phân tử proline chiếm vị trí của Yaa và được hydroxyl hóa thành Xaa-Hyp-Gly. Sự thay đổi này làm tăng tính ổn định của cấu trúc xoắn bậc III. Hydroxyproline có mặt trong rất ít loại protein khác, vì vậy, nỉ được xem như là thành phần được sử dụng để định lượng collagen và hoặc genlatin.
Quá trình hydroxyl hóa proline cần có vitamin C, nên tác động sớm nhất và rõ ràng nhất của thiếu vitamin C ở con người đó là các vấn đề về lông, túc và lợi (bệnh sco-bút) do khiếm khuyết quá trình hydoxyl hóa proline trong phân tử collagen, gây nên giảm tính ổn định của nó. Tăng nồng độ hydroxyproline trong huyết tương và nước tiểu còn gặp trong bệnh Paget
Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tách tương đối mới và mạnh mẽ. So với HPLC, kỹ thuật này cung cấp độ phân giải tốt hơn, thời gian phân tích ngắn hơn, tiêu tốn ít dung dịch đệm hơn và sử dụng thể tích mẫu bé hơn. Nguyên lý của điện di mao quản dựa trên tốc độ di chuyển khác nhau của các thành phần phân tích trong điện trường, điều này là nhờ sự khác nhau về tỷ lệ khối lượng/điện tích. Trong điện di mao quản, ưu điểm đáng kể ở tốc độ phân tách, hiệu quả và độ phân giải đến từ từ trường rất mạnh
1.. Các thực nghiệm đánh giá phương pháp (method validation)
Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy.
1.3.1. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Khoảng tuyến tính rộng hay hẹp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng.
Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trăm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn. Tiến hành xây dựng đường chuẩn bằng cách phân tích dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ). Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương tr (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
h: y = ax v à hệ số tương quanR
Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of correlation). R phải đạt theo yêu cầu sau:
0,995 ≤ R ≤ 1 Hay 0,99 ≤ R2≤ 1, khi đó, phương pháp có sự tuyến tính rất chặt chẽ.
1.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD)
- Giới hạn định lượng (LOQ) là giới hạn nồng độ thấp nhất mà tại đó phương pháp phân tích vẫn đảm bảo độ chính xác với CV ≤ 20%. LOQ được xác định bằng phân tích các dung dịch acid amin chuẩn ở các mức độ khác nhau trong một lần chạy. Pha loãng dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất để thu được các dung dịch có tỷ lệ pha loãng 2, 4, 8, 16, 32, 64… lần. Các chuẩn pha loãng được chạy lặp lại 3 lần trong một mẻ phân tích. Tính và đánh giá
CV, từ đó tìm ra LOQ là giá trị nồng độ thấp nhất mà tại đó phương pháp vẫn còn đảm bảo độ chính xác (CV ≤ 20%)
- OD là giới hạn phát hiện. Có nhiều cách khác nhau xác định LOD tùy thuộc vào phương pháp áp dụng. Cách tiếp cận có thể chấp nhận được : Dựa trên độ lệch chuẩ : Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần như mẫu thử nhưng không có chất phân tích). Phân tích mẫu 20 lần song song, tính độ lệch chu n. Độ lệch chuẩn này phải khác “0.
LOD = Trung bình + 2SD
Có thể xác định dựa theo định nghĩa về LOD: tiến hành phân tích một loạt nồng độ thấp dần so với giới hạn định lượng (LOQ). LOD sẽ là giá trị thấp nhất mà tại đó còn phát hiện được tín hiệu của chất phân tích. Đối với sắc ký thì tín hiệu phát hiện chính là diện tích của peak (area) trên sắc đồ.
1.3.3. Độ chính xác
Độ chính xác ngắn hạn: Kiểm tra khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của chính mẫu đó cho dù nó được đặt ở bất kỳ vị trí nào trong lần chạy. Để đánh giá tính chính xác ngắn hạn, hoặc mẫu bệnh phẩm hoặc QC được đặt ở các vị trí bất kỳ trong lần chạy đó. Tính SD và CV của các kết quả thu được. CV phải nhỏ hơn hoặc tương tự như giá trị của nhà sản xuất đưa ra hoặc trong giới hạn được định nghĩa trước đó. Phần lớn các phương pháp hóa sinh nên có CV dưới 5%.
Độ chính xác dài hạ: Đánh giá khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của một mẫu khi chạy nhiều lần khác nhau. Độ chính xác dài hạn ng cần phải được kiểm tra ở ít nhất hai nồng độ khác nhau. Các nồng độ này đặc trưng cho các giá trị thấp, trung bình, cao trong khoảng tuyến tính đã thiết lập được và
tương ứng với các giá trị gặp ở bệnh nhân. Các nồng độ này thường liên quan đến các điểm có tính quyết định về y học.
Một phương pháp thống kê khác có thể dựng đánh giá độ chính xác là thử nghiệm F (Fisher’s test . Test F được dựng so sánh độ chính xác của phương pháp mới với phương pháp tham chiếu hoặc các công bố của nhà sản xuất
1.3.4. Độ thu hồi
Trong nhiều trường hợp không thể tìm hoặc áp dụng một phương pháp tiêu chuẩn để so sánh kết quả, cũng như không thể dễ dàng có được các mẫu chuẩn hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận phù hợp với phương pháp. Việc xác định độ đúng do đó có thể thực hiện thông qua xác định độ thu hồi (còn gọi là độ tìm lại) của phương pháp. Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử, phân tích các mẫu thử thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu ba lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:
(C: nồng độ)
Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại. Để thu được kết quả phân tích độ thu hồi đáng tin cậy, thể tích chuẩn thêm vào không được vượt quá 10% tổng thể tích nhằm hạn chế sự phá vỡ nền mẫu.
Tiêu chí đánh giá: Sau khi đánh giá độ thu hồi, so sánh kết quả với các giá trị cho trong bảng sau. Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau. Trong trường hợp phân tích các chất hàm lượng vết có thể tham khảo tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa phân tích (AOAC
Bảng 1. : Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC
Stt Hàm lượng [%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi
1 100 1 100% 98-102 2 ≥ 10 10-1 10% 98-102 3 ≥ 1 10-2 1% 97-103 4 ≥ 0.1 10-3 0.1% 95-105 5 0.01 10-4 100 ppm 90-107 6 0.001 10-5 10 ppm 80-110 7 0.0001 10-6 1 ppm 80-110 8 0.00001 10-7 100 ppb 80-110 9 0.000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
1.4. Bệnh RLCHBS, vai trò của xét nghiệm phân tích acid amin trong đánh giá RLCHBS.
1.4.1. Định hướng chẩn đoán bệnh RLCHBS.
Các dấu hiệu gợi ý RLCHBS:
- Tiền sử gia đình có người thân bị bệnh RLCHBS.
- Các xét nghiệm trong chương trình sàng lọc RLCHBS cho kết quả dương tính.
- Các dấu hiệu tâm thần kinh: li bì, hôn mê, co giật, động kinh, nôn vọt, tăng trương lực cơ, giảm trương lực cơ, chậm phát triển tâm thần vận động,…
- Các dấu hiệu bệnh lý gan mật: gan to, vàng da, các dấu hiệu suy gan không rõ nguyên nhân như tăng NH3 máu, hạ protid máu, rối loạn đông máu, tăng men gan
- Biểu hiện tim mạch: bệnh lý cơ tim giãn, suy tim không tìm thấy căn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});