uật :
Mẫu thử được khử protein bằng dung dịch acid sulfosalicylic (SSA) chứa nội chuẩn norvalin (Nva) . Phương pháp phân tích acid amin bao gồm các giai đạ
sau :
(1) Kiềm hoẫu chuẩ n, mẫu thử , mẫu trắng (blank) đã được khử tạp bởi SSA bằng dung dịch Na
/ borat.
(2) Phản ứng tạo n xuất:
- Dẫn xuất hoá các acid amin trong mẫu thử bằng AQC (6-aminoquinolyl- N-hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển các acid amin bậc một và bậc hai thành các chất có thể phát hiện được bằng đầudòcc
m ( UV ) .
- Phản ứng tạo dẫn xuất hồn tồn địi hỏi một lượng dư số mol AQC. Lượng dư này sẽ bị thủy phân thành sản phẩm phụ là 6-aminoquinoline (AMQ), N-dư này sẽ bị thủy phân thành sản phẩm phụ là 6-aminoquinoline (AMQ), N-dư này sẽ bị thủy phân thành sản phẩm phụ là 6-aminoquinoline (AMQ), N- dư này sẽ bị thủy phân thành sản phẩm phụ là 6-aminoquinoline (AMQ), N- hydoxysuccnmide (NSH ) và CO 2 , những sản phẩm phụ này không gây cản trở cho q trình phân tích. Riêng AMQ sẽ tạo ra một peak có ý nghĩa và dễ dàng nhận biết được. Phản ứng thủy phân này xảy ra chậm hơn so với ph
ứng tạo dẫ xuất.
- Lưu ý: C reatinine không được dẫn xuất bởi thuốc thử AMQ nên sẽ không xuất hiện peak sắ ký đối với creatin ine. Riêng urê sẽ được dẫn xuất kép (o cấu tạo phân tử đ ặc biệt) để tạo nên dẫn xuất urê đối xứng. Peak của urê sẽ được Derivation Peakđánh dấu bằng ch
“ ” trên sắc ký đồ
- Phân tách các dẫn xuất AQC của acid amin bng phương pháp UPLC , định lư
[
30
Hình 2.1: P hản g tạodẫnxuất
2.2.2 . T hiết lập các thông số cho h
[ 30 ]
+ N hiệt độ làm việcủa cột: 43°C ( theo quy trình chuẩn của Waters), có thể thay đổi nhiệt độ làm việc của cột trog giới hạn từ 30-50 °C theom
đíh thử nghiệm .
+ Á p suất làm việc của cột: giới hạ trê là 15.000 psi
+ H ệ thống làm m đặ ở chế độ 20°C
+ Đ ầu dị UV: thiết lập bước sóng phân tích là 260 nm, tốc độ thu nhận dữ
ệuà 20 điểm/giây
+ T ốc độ của bơm tiêm mẫu là 30 µL/phút, thời gian giữa hai lần t m mu là 45 phút.
+ D ung dch rửa kim tiêm lỏng : 5 5 aetonitrile/nước
+ D ungdịch rửa kim đậm đặc : 9 5 acetonitrile/nước
StandadGadint
Bảng 2 . 1 : G radient của phương
Thời gian Tốc độ mL/Phút %A %B Curve
1 0.400 99.9 0.1 6 2 1.14 0.400 99.9 0.1 6 3 2.0 0.400 98.5 1.5 6 4 5.5 0.400 98.1 1.9 6 5 6.5 0.400 98.0 2.0 5 6 10.0 0.400 97.6 2.4 6 7 12.0 0.400 96.0 4.0 6 8 20.0 0.400 88.0 12.0 6 9 35.0 0.400 85.0 15.0 5 10 36.0 0.400 2.0 98.0 6 11 38.0 0.400 2.0 98.0 6 12 39.0 0.400 99.9 0.1 6 13 45 0.400 99.9 0.1 6 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
p UPLC tiêu chuẩn
+ Gradient có thể được cải tiến để thăm dò hiệu năng phân tách tại mỗi thời điểm khác nhau dựa trên sự thay đổi pH c
pha i động A & B.
2.2.3 . Xử lý mẫu bệnh phẩm và tạo dẫn xuất mẫu thử, mẫu trắng và mẫu chuẩn
30 ]
- Loại protein
ỏiẫu huyết tương.
+ T rong một ống ly tâm, cho 250 µL huyết tương ùng với 250 µL dung d ịch SSA 1% và norvaline 250 µM , sau đó tr
đề bằng máy vortex
+ L y tâm dung dịch trong thời gian 5 phút ở t độ13.000 vòng/phút
+ T hu dịch nổi vào trong lọ thủ
tinh dung tích5 mL. - Quy t
nhn xất mẫu thử
+ H ơ t 6 0 µL dung dịch đệm rat/NaOH vào một lọ
+ T hâm 20 µL dịch nổi sau ly tâm mẫu huyết ươn đã loại protein
+ T rộn đều hỗn hợp bằng máy ortx trong vài giây
+ S au đó bổ sung 20 µL dung dịch t ốc thử MssTrak AAA
+ Đậy n ắp lọ và rộn bằng máy
rtex t rong vài giây
- Quy trình dẫn xuất mẫu chuẩn ( 5 pol/µL trên cột)
+ H t lần lượt vào một lọ : 70 µL đệm MassTrak AAA borate buffer + 10 µL hỗn hợp acid amin nồng độ 250 pmol/µL hoặc tryptophan 250 pmol/µL (trong trường hợp dẫn xuất iêng u cuẩn trypt ophan)
+ N ắp lọ và trộn bằn vorex trong 10 giây
+ T hâm vào lọ 20 µL dung dịch t ốchử MassTrak AAA
+ T hay nắp lọ và trộn hỗn hợp bằng ortx trong vài giây
+ Đ ể mẫu ở nhiệt độ phòng trong vịng 1 phút sau đó ủ lọ tên áy 10 phút ở 55 °C
- C huẩn
mẫ trắng gradient:
+ H út vào lọ 80 µL dung dịch đệm MassT
k AA borate buffer
+ T hâm 20 µL dung dịch thuốc thử MassTrak AAA reage diuent vào lọ trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Đ ậy nắp lọ, trộn đều bằng máy ortx trong vài giây
+ Đ ể lọ ở nhiệt độ phịng 1 phút sau đó ủ lọ tên
áy ủ 10 phút ở 55 °C -
o dn xuất mẫu trắng
+ H út vào lọ 80 µL dung dịch đệm MassT k AA borate buffer
+ T hâm 20 µL dung dịch thuốc thử đã được khôi phục MassTrak A regent vào lọ trên
+ N ắp lọ và trộn bằng máy ortx trong vài giây
+ Đ ể lọ ở niệt độ phòng 1 phút s au đó ủ lọ tên
áyủ 1 phút ở 55 °C
h sinh ọc bằng UPLC 2.2.4.1 . Khảo sát độ tuyến
ín của phương pháp:
Ch uẩn ị hai hỗn hợp chuẩn . Hỗn hp thứ nhất là chuẩn 0 . Hỗn hợp thứ hai là chuẩn nồng độ cao gần với hoặc cao hơn giá trị trên dự đoán của khoảng phân tích. Trộn hai mẫu chuẩn trên với các tỷ lệ
hể tíchbảg sau:
Bảng 2 . 2 : C ách pha các nồng độ
Chuẩn 0 Chuẩn nồng độ cao
Mẫu 1 100% 0 % Mẫu 2 80% 20% Mẫu 3 60% 40% Mẫu 4 40% 60% Mẫu 5 20% 80% Mẫu 6 0% 100% ảo sát độ tuyến tính
Tiến hành phân tích định lượng các acid amin trong 6 mẫu trên. Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần. Tính giá trị trung bình
u. [ 31 ]
Vẽ đồ thị để đánh giá độtuyến tính bằng phần mề m được tích hợp trong hệ thống UPLC với: trục hoành X là nồng đ pha long theo bảng trên ( 0,20% , 40%, 60%, 80%, 100% ) , trục tung Y là ồng độ trung bình đo được
m ỗi nồng độ được tiến hành đo 3 lần, kết quả cuối cùng sẽ là Y= (Y1+Y2+Y3)/3. Từ đó, thiết lập phương trình Y = aX + b . Tính đưc hệ số tương quan R, nếu R 2 ≥ 0,99 thì chấp nhận dải giá trị này, nếu khơng đạt thì phải thu hẹp dải nồg độ cho
n khi đt đượ R 2 ≥ 0,99.
2.2.4.2 . Khả o sát giới hạn định lượng (OQ)và
iới hạn phát hiện ( LOD )
- LOQ được xác định bằng phân tích các dung dịch acid amin chuẩn ở các mức độ khác nhau trong một lần chạy. Pha lỗng dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất để thu được các dung dịch có tỷ lệpha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64 … lần. Các chuẩn pha loãng được chạy lặp lại 3 lần trong một mẻ phâ tích. Tính và đáh giá SD và CV , từ đó tìm ra LO Q là giá trị nồng độ thấp nhất mà tại đó phương pháp vẫn cịn tuyế tính chặt chẽ với R >0.99, SD v
CV vn trong giới hạn cho phép
- LOD : Tiến hành đo lặp li20 lần đối với mẫu trắng (blan k ). Tính trung bình X và SD của từng acid amin.
D được xác đị
the côg thức: LOD = X + 2SD 2.2.
3 . Độ thu hi của phương pháp.
Tiến hành đá nh giá độ thu hồi trên mẫu QC. Mẫu QC được tạo ra bằng cách trợn 30 mẫu huyết tương của trẻ trong nhóm chứng ở độ tuổi 1- 5, với thể tích mỗi mẫu 250 µL. C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
h iến hành thêm chuẩn nhưsu: QC (-) : 90µ QC + 10 µL H 2 0
QC (+): 90 µL QC + 10 µ dung dịch acid amin chuẩn 500 ( µmol/L) => Mẫu thêm chuẩn QC (+) sẽ được tăng thêm 50 µmol/L so với mẫu thêm nước
Q (- (về mặt lý thuyết) . Các mẫu QC (-) và QC(+) sẽ được tiến hành đo lặp lại 3 lần để tính nồng độ trung bình, sau đ
thu hồi theo cơng thức:
Tiêu chuẩn chấp nhận: theo AOAC, đối i ồg độ cất phân ích ở mức
10 - 6 - 10 -4 mol/L , độ thu hồi c
mứ 80-10%. [ 25 ] 2. 24 − . Độ chính xác của phương phápXá định độ chính xác ngắn hạn : m ẫu QC được tạo từ huyết tương của trẻ ở nhm chứng được phân tích trong m ột lần chy, mỗi ẫu QCđưc đo lặp lại 1 0 lần ( n = 1 0) , thu thập dữ liệu vđ
− h giá độ chính xác ngắn hạn . Xácđịnh độ chính xác dài hạn : m ẫu QC được chạy trong 20 mẻ khác hau (n=20) trog vòng 3 tháng , trong mỗi mẻ , mẫu QC được đo lặp lại 3 lần, thu thập dữ liệu vàđá
Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên CV để đánh giá độch
− h xác ngắn hạn và dài hạn .
Tiêuchuẩn chấp nhận: theo AOAC, đ ộ chính xác chấp nhậnđưc ki phân tích nồng độ 10 -6 -10 -4 mol/L là CV < 11 đối với độ chính xác dài hạn , và CV < 5.3% đ
ngắn ạn.
[
25 ]
2.2.5 . Áp dụng phương pháp phân tích acid amin bằng UPLC tro
phân tích các mẫu bệnh phẩm - Tiến hành xử lý v
phân tích mẫu theo quy trình.
- Định lượng acid amin trong máu và nước tiểu của nhóm chứng để xác định giá tr trung bình, SD, CV. Đồng thời , so sánh giá trị thu được ở mẫu máu và nước tiểu của hai nhóm chứng với giá trị tham chiếu được công bố trên thế giới (được ghiên cứu trên quần thể đủ lớn có tính đại diện cho quần thể ), sau đó áp dụng quy tắc 18/20. Nếu có tối thiểu 18/20 (90%) mẫu nằm trong giới hạn bình thường của khoảng tham chiếu thì cơng nhận khoảng tham chiếu trên là phù hợp và tin cậy. Nếu có ít hơn 18/20 mẫu nằm tong giới hạn bình thường của k hoảng tham chếu, lúc này cần đánh giá một khoảng tham chiế của tác giả k hác để tìm
a k hoảng tham chiếu phù hợp.
- Kết quả thu được trên phân tích mẫu bệh lý sau đó được so sánh với k hoảng tham chiếu để đưa ra chẩn đoán xác định hoặc định hướng chẩn đoán. Đối với một số bệnh RLCHB, chẩn đoán xác định dựa trên k ết quả phân tích
acid amin (MSU), đốivới một số bệnh RLCHBS k hác, k ết quả phân tích acidamin có giá trị định hướng để t iến hành phân tích đột biến gen nhằ
đưa r chẩn đoán xác định bệnh.
- 2.6 . Vấn đề đạo đức của đề tài
Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hồn tồn tự nguyện và có quyền rút lui khỏi nghiên c
- khi không muốn tham gia nghiên cứu. Các thông tin liên q
n đến bệnh nhân được đảm bảo bí mật.
Đề tài nghiên cứu này được thực hiện hồn tồn vì mục đíc
học chứ
hơng vì mục đích n hác.
Chương 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Khảo sát ảnh hưởng c
ệt độộtđếnhiệu năng phân tách
Hình3 .
. K ết qả phân tích ở nhiệt độ 38 0 C
Nhận xét : Sự thay đổi nhỏ ở nhiệt độ sẽ tạo ra sự thay đổi đáng kể trong sắc đồ, trên đây là minh họa về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân tách ở phút 3-9 & 20-24- đây là vùng chịu sự chi phối lớn nhất về nhiệt độ và cũng là thử thách lớn nhất khi phân tách (các vùng thời gian kh
ít biến thiên khi thay đổi nhiệt độ).
Argvà Gy không tách được,Lys peak dẫn xuất ( Deri ) xuất hiện trước và Tyr. His và PEA tách được một phần, hiệu năng tách chưa cao. Nhiệt độ hạ thấp làm tăng hiệu năng phâ
vùnghờ gin lưu ở phút 20-24 .
Hình3 .
. K ết quả phân tích ởnhiệt độ 40 0 C
Nhận xét: Arg và Gly k hông thể tách được. HiLysệu năng phân tách của cặp His+PEA, Deri+ giảm so với ở 38C. Ở các peak còn lại hiệu năng
phân tách khơng có sự khác biệt khi thay đổi nhiệt độ. Sự thay đổi thời gian lưu của từng peak không tương quan với sự thay đổi nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ c
Hình .3 .
ết quả phâ tích ở nhiệt độ 41.2 0 C,
Nhận xét: ú sự cải thiện rõ ở tất cả các cặp pea k khLysó phn
Hình3 .4
K ết qu phn tích Lysở nhiệt độ 420C:
Nhận xét : C ặp cặp +Tyr bị chồ g , cặp His+PEA phân tách không hoàn toàn . Sự phân tách của các ặ E
Hnh
.5 . K ết qả phân tích ở nhiệt độ 43 0 C
Nhận xét: N hiệt độ được khuyến cáo bởi Waters trong quy trình chuẩn. Hiệu nănLysg phân tách km ở các cặp His+PEA, LysEA+Asp, +Tyr, Arg+Gl
Hnh 3
6 . K ết qu phân tích ở nhiệt độ 48 0 C:
Nhận xét: H iệu quả phân tách của cặp His+PEA, EA+Asp giảm khi ăng nhiệt độ,song có sự cải thiện rõ ở nh úm Arg+Gly C ú sự thay đổi tLysrật tự xuất hiện các pea k: Deri đứng giữa và Tyr thay vì đến trước so
i kt quả phân tích ở nhiệt độ thấp hơn. 3.2 . Ảnh hưởng của
pha độg ến hệu năng phân tách.
y đổi thành phần ph a di động A-B.
Nhận xét: Tên hình nền sẫm màu là sắc đồ sử dụng gr adient của Waters, nền trắng là gradient đã được thay đổi tỷ lệ thebảg dưới đây, khảo sát ở nhiệt độ 41.2 0 C . Chúng tôi đã thu được sự cải thiện rõ rệt tại các thời gian lưu xuất hiện các cặp peak khó phân
ách: Hs/EA,Arg/Gly, EA/Asp, Lys/Tyr. Bảng 3 .
Gradient tiêu chuẩn (Waters) Gradient cải tiến (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian mL/Phút %A %B Curve Thời gian %A %B Curve
0.400 99.9 0.1 6 99.9 0.1 6 1.14 0.400 99.9 0.1 6 1.14 99.9 0.1 6 2.0 0.400 98.5 1.5 6 2.0 98.5 1.5 6 5.5 0.400 98.1 1.9 6 4.5 98.1 1.9 6 6.5 0.400 98.0 2.0 5 5.5 98.1 1.9 6 10.0 0.400 97.6 2.4 6 6.5 98.0 2.0 5 12.0 0.400 96.0 4.0 6 7 97.5 2.5 5 20.0 0.400 88.0 12.0 6 8 97.9 2.1 5 35.0 0.400 85.0 15.0 5 10.0 97.6 2.4 6 36.0 0.400 2.0 98.0 6 12.0 96.0 4.0 6 38.0 0.400 2.0 98.0 6 20.0 87.0 13.0 6 39.0 0.400 99.9 0.1 6 21 88.0 12.0 6 45 0.400 99.9 0.1 6 35.0 85.0 15.0 5 36.0 2.0 98.0 6 38.0 2.0 98.0 6 39.0 99.9 0.1 6 45 99.9 0.1 6
o sánh gradient của hai phương pháp
Nhận xét: Thay đổi tỷ lệ A/B có ý nghĩa trong việc thay ổ nhẹmức pH tại mỗi thời điểm mongmuố n , tạ i phútLys4.5 (His+PEA), 7 (Arg) , 8 (Gly) và 20 ( +Tyr) giảm %A và tăng % B làm tăng nhẹ pH của hỗn hợp pha di
động. Phút 21 đặt lại tỷ lệ ban ầu nhằm thiết lập pH như trong trong ph ương pháp tiêu chuẩn. Kết quả được cải ti
sakhi thay đổi tỷ lệ % giữa A và B . 3.3 . Đánh giá hiệu năng ph
tách khi sử dụng pha động B tự pha chế
Sau khi đã tối ưu được nhiệt độ và gradient, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với dung dịch B tự pha (do B có thành phần đơn giản, chỉ gồm ≥ 95% acetoitrile, ≤ 5% acetic acid). Chúng tơi quy ết định thử nghiệm phân tích mẫu bằng dung dịch B tự pha
ới
acetoitilevà 2% acetic acid.
quả thử nghiệm với dung dịch B tự pa Nhận xét: Hiệu năngphân tách ở 41.2 0 C, gradient cải tiế n và dung dịch B tự pha là tương tự so với hiệu năng ở cùng nhiệt độ, cùng gradient chạy với dung dịch B thương mại của Waters. Các cặp H
+PA, Asp+EA được phân tách rõ nét. 3. 4 .
hảo sát sự tuyến tính của phương pháp
Sử dụng dung dịch ch̉n gớc M1vinồng độ các acid amin 1000 µmol/L và H 2 O chuẩn HPLC để pha loãng thành các nồng độ mong muốn. Tiến hành dẫn xuất và phân tích sự tuyến tính với độ lặp lạmỗi mẫu là 3 lần trong cùng một lần chạy , kt quả được xử lý bằng phần mềm Empo
r 2 .0àđượ trình bày theo bảng sau. Bảng 3 . 2 . K hảo sá
T
T Acid amin R R
2 Phương trình TT Acid amin R R2 Phương trình
1 Pser 0.987067 0.974302 Y = 5.72 e-1 X 23 Thr 0.999972 0.999944 Y = 9.27 e-1 X 2 Ala 0.999810 0.999620 Y = 8.50 e-1 X 24 AADA 0.999243 0.998487 Y = 7.34 e-1 X 3 Hypro 0.999095 0.998192 Y = 9.25 e-1 X 25 Pro 0.999984 0.999968 Y = 8.38 e-1 X 4 NH3 0.979975 0.960351 Y = 1.05 X 26 BAIB 0.999739 0.999477 Y = 8.66 e-1 X 5 His 0.998439 0.996881 Y = 9.69 e-1 X 27 Hyl2 0.999964 0.999929 Y = 7.56 e-1 X 6 PEA 0.987842 0.975832 Y = 6.46 e-1 X 28 Hyl1 0.999953 0.999905 Y = 6.26 e-1 X 7 Asn 0.999897 0.999793 Y = 5.70 e-1 X 39 AABA 0.999979 0.999957 Y = 8.79e-1 X