ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACIDAMIN

1.2. .4 ĐO NỒNG ĐỘ ACIDAMIN HUYẾT TƯƠNG TONG DỊCH SIÊU LỌC BẰNG HPLC VỚ

1.2.5.5. ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH 4-HYDROXYPROLINE VÀ CÁC ACIDAMIN

amin khác

- hydroxyproline được tạo thành từ quá trình hydroxyl hóa proline bởi

enzyme prolyl hydroxylase sau khi prl ine tham gia tổng hợp protein( thay đổi sau dịch mã). Phản ứng xảy ra trong lưới nội sinh chất. Mặc dù không trực tiếp hợp thành nên protein, hydroy proline chiếm khoảng 4% trong tổng số acid amin được tìm thấy trong mơ cơ th

Hydroxyproline là thành phần chính của collagen, cùng với proline đóng vai trị then chốt trong tính ổn định của collagen. Chúng cho phép duy trì cấu trúc xoắn ốc sắc nét của collagen. Trong cấu tạo kinh điển của collagen, bộ ba Xaa-Yaa—Gly (Xaa và Yaa là các acid amin bất kỳ) , một phân tử proline chiếm vị trí của Yaa và được hydroxyl hóa thành Xaa-Hyp-Gly. Sự thay đổi này làm tăng tính ổn định của cấu trúc xoắn bậc III. Hydroxyproline có mặt trong rất ít loại protein khác, vì vậy, nỉ được xem như là thành phần được sử dụng để định lượng collagen và hoặc genlatin.

Q trình hydroxyl hóa proline cần có vitamin C, nên tác động sớm nhất và rõ ràng nhất của thiếu vitamin C ở con người đó là các vấn đề về lơng, túc và lợi (bệnh sco-bút) do khiếm khuyết q trình hydoxyl hóa proline trong phân tử collagen, gây nên giảm tính ổn định của nó. Tăng nồng độ hydroxyproline trong huyết tương và nước tiểu còn gặp trong bệnh Paget

Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tách tương đối mới và mạnh mẽ. So với HPLC, kỹ thuật này cung cấp độ phân giải tốt hơn, thời gian phân tích ngắn hơn, tiêu tốn ít dung dịch đệm hơn và sử dụng thể tích mẫu bé hơn. Nguyên lý của điện di mao quản dựa trên tốc độ di chuyển khác nhau của các thành phần phân tích trong điện trường, điều này là nhờ sự khác nhau về tỷ lệ khối lượng/điện tích. Trong điện di mao quản, ưu điểm đáng kể ở tốc độ phân tách, hiệu quả và độ phân giải đến từ từ trường rất mạnh

1.. Các thực nghiệm đánh giá phương pháp (method validation)

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần khơng thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy.

1.3.1. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.

Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Khoảng tuyến tính rợng hay hẹp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng.

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trăm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn tồn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu khơng được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn. Tiến hành xây dựng đường chuẩn bằng cách phân tích dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ). Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương tr

h: y = ax v à hệ số tương quanR

Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of correlation). R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 Hay 0,99 ≤ R2≤ 1, khi đó, phương pháp có sự tuyến tính rất chặt chẽ.

1.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn định lượng (LOQ) là giới hạn nồng độ thấp nhất mà tại đó phương pháp phân tích vẫn đảm bảo độ chính xác với CV ≤ 20%. LOQ được xác định bằng phân tích các dung dịch acid amin chuẩn ở các mức độ khác nhau trong một lần chạy. Pha lỗng dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất để thu được các dung dịch có tỷ lệ pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64… lần. Các chuẩn pha loãng được chạy lặp lại 3 lần trong một mẻ phân tích. Tính và đánh giá

CV, từ đó tìm ra LOQ là giá trị nồng độ thấp nhất mà tại đó phương pháp vẫn cịn đảm bảo độ chính xác (CV ≤ 20%)

- OD là giới hạn phát hiện. Có nhiều cách khác nhau xác định LOD tùy thuộc vào phương pháp áp dụng. Cách tiếp cận có thể chấp nhận được : Dựa trên độ lệch chuẩ : Làm trên mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần như mẫu

thử nhưng khơng có chất phân tích). Phân tích mẫu 20 lần song song, tính độ lệch chu n. Độ lệch chuẩn này phải khác “0.

LOD = Trung bình + 2SD

Có thể xác định dựa theo định nghĩa về LOD: tiến hành phân tích một loạt nồng độ thấp dần so với giới hạn định lượng (LOQ). LOD sẽ là giá trị thấp nhất mà tại đó cịn phát hiện được tín hiệu của chất phân tích. Đối với sắc ký thì tín hiệu phát hiện chính là diện tích của peak (area) trên sắc đồ.

1.3.3. Độ chính xác

Độ chính xác ngắn hạn: Kiểm tra khả năng của một phương pháp lặp

lại kết quả của chính mẫu đó cho dù nó được đặt ở bất kỳ vị trí nào trong lần chạy. Để đánh giá tính chính xác ngắn hạn, hoặc mẫu bệnh phẩm hoặc QC được đặt ở các vị trí bất kỳ trong lần chạy đó. Tính SD và CV của các kết quả thu được. CV phải nhỏ hơn hoặc tương tự như giá trị của nhà sản xuất đưa ra hoặc trong giới hạn được định nghĩa trước đó. Phần lớn các phương pháp hóa sinh nên có CV dưới 5%.

Độ chính xác dài hạ: Đánh giá khả năng của một phương pháp lặp lại kết

quả của một mẫu khi chạy nhiều lần khác nhau. Độ chính xác dài hạn ng cần phải được kiểm tra ở ít nhất hai nồng độ khác nhau. Các nồng độ này đặc trưng cho các giá trị thấp, trung bình, cao trong khoảng tuyến tính đã thiết lập được và

tương ứng với các giá trị gặp ở bệnh nhân. Các nồng độ này thường liên quan đến các điểm có tính quyết định về y học.

Một phương pháp thống kê khác có thể dựng đánh giá độ chính xác là thử nghiệm F (Fisher’s test . Test F được dựng so sánh độ chính xác của phương pháp mới với phương pháp tham chiếu hoặc các công bố của nhà sản xuất

1.3.4. Độ thu hồi

Trong nhiều trường hợp khơng thể tìm hoặc áp dụng một phương pháp tiêu chuẩn để so sánh kết quả, cũng như khơng thể dễ dàng có được các mẫu chuẩn hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận phù hợp với phương pháp. Việc xác định độ đúng do đó có thể thực hiện thơng qua xác định độ thu hồi (cịn gọi là độ tìm lại) của phương pháp. Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử, phân tích các mẫu thử thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu ba lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:

(C: nồng độ)

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại. Để thu được kết quả phân tích độ thu hồi đáng tin cậy, thể tích chuẩn thêm vào khơng được vượt q 10% tổng thể tích nhằm hạn chế sự phá vỡ nền mẫu.

Tiêu chí đánh giá: Sau khi đánh giá độ thu hồi, so sánh kết quả với các

giá trị cho trong bảng sau. Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau. Trong trường hợp phân tích các chất hàm lượng vết có thể tham khảo tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa phân tích (AOAC

Bảng 1. : Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC

Stt Hàm lượng [%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi

1 100 1 100% 98-102 2 ≥ 10 10-1 10% 98-102 3 ≥ 1 10-2 1% 97-103 4 ≥ 0.1 10-3 0.1% 95-105 5 0.01 10-4 100 ppm 90-107 6 0.001 10-5 10 ppm 80-110 7 0.0001 10-6 1 ppm 80-110 8 0.00001 10-7 100 ppb 80-110 9 0.000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0.0000001 10-9 1 ppb 40-120

1.4. Bệnh RLCHBS, vai trị của xét nghiệm phân tích acid amin trong đánh giá RLCHBS.

1.4.1. Định hướng chẩn đoán bệnh RLCHBS.

Các dấu hiệu gợi ý RLCHBS:

- Tiền sử gia đình có người thân bị bệnh RLCHBS.

- Các xét nghiệm trong chương trình sàng lọc RLCHBS cho kết quả dương tính.

- Các dấu hiệu tâm thần kinh: li bì, hơn mê, co giật, động kinh, nôn vọt, tăng trương lực cơ, giảm trương lực cơ, chậm phát triển tâm thần vận động,…

- Các dấu hiệu bệnh lý gan mật: gan to, vàng da, các dấu hiệu suy gan không rõ nguyên nhân như tăng NH3 máu, hạ protid máu, rối loạn đông máu, tăng men gan

- Biểu hiện tim mạch: bệnh lý cơ tim giãn, suy tim khơng tìm thấy căn nguyên thực thể ở van tim.

- Tiêu chảy kéo dài

- Nhiễm toan lactic, toan ceton - Hạ calci máu

- Cơ thể, các dịch sinh học xuất hiện mùi lạ.

1.4.2. Phân loại RLCHBS

Dựa theo sinh lý bệnh học, RLCHBS có thể được chia thành 3 nhóm lâm sàng:

- Nhóm 1: Các rối loạn làm tăng sản sinh độc tố trong cơ thể. Nhóm

này bao gồm các khiếm khuyết bẩm sinh của con đường chuyển hóa trung gian dẫn tới tình trạng nhiễm độc cấp tính hoặc tiến triển do sự tích đọng các độc chất do bị chặn trong chuỗi phản ứng chuyển hóa. Nhóm này bao gồm: phenylceton niệu, bệnh nước tiểu có mùi syro lá phong do rối loạn chuyển hóa leucine, isoleucine và valine (MSUD-maple syrup urine disease), hầu hết các nhiễm toan acid hữu cơ niệu, khiếm khuyết chu trình urê, khơng dung nạp đường (galactose, fructose), nhiễm độc kim loại (Fe, Cu) và bệnh porphyrin. Tất cả các bệnh này cùng chung những đặc điểm lâm sàng giống nhau: Chúng không làm cản trở sự phát triển của bào thai. Sự biểu hiện lâm sàng thường bắt đầu muộn và lúc có lúc khơng. Các điều kiện gây khởi phát có thể là do q trình dị hóa, sốt, ốm tái đi tái tại và nguồn gốc có thể từ thức ăn được ăn vào. Chẩn đoán thường dễ dàng và chủ yếu dựa vào định lượng acid amin, acid hữu cơ máu và nước tiểu, định lượng acylcarnitine trong máu.

- Nhóm 2: các rối loạn liên quan đến chuyển hóa năng lượng, bao gồm

các RLCHBS qua trung gian chuyển hóa với những triệu chứng do khiếm khuyết trong sản sinh hoặc sử dụng năng lượng ở gan, tim, não, cơ và các mơ khác. Nhóm này lại được chia thành các khiếm khuyết có nguồn gốc ty thể và

bào tương. Các khiếm khuyết có nguồn gốc ty thể thường nặng và khơng có khả năng chữa khỏi. Chúng bao gồm nhiễm toan lactic máu bẩm sinh, rối loạn chuỗi hô hấp tế bào, rối loạn tạo thể ceton niệu và oxy hóa acid béo. Khiếm khuyết có có nguồn gốc bào tương thì ít nghiêm trọng hơn, gồm rối loạn chuyển hóa đường, hội chứng tăng insulin máu, rối loạn chuyển hóa creatin và rối loạn bẩm sinh trong con đường pentose phosphat (không thể điều trị khỏi). Một số rối loạn có nguồn gốc ty thể và rối loạn con đường pentose phosphate gây ảnh hưởng đến sự phát triển bào thai. Chẩn đốn khó và phải dựa trên test đánh giá chức năng, phân tích enzym và phân tích gen.

- Nhóm 3: Các rối loạn liên quan đến những phân tử phức tạp, bao gồm

bào quan và các bệnh gây ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp và dị hóa những phân tử phức tạp. Triệu chứng thường xảy ra cố định, tiến triển và không liên quan đến thức ăn. Nhóm này bao gồm các bệnh: rối loạn dự trữ ở lysosom, rối loạn peroxysom, rối loạn vận chuyển alpha-1-antitrypsin, rối loạn bẩm sinh glycosyl hóa, và rối loạn tổng hợp cholesterol.

1.4.3. Vai trị của xét nghiệm phân tích acid amin trong đánh giá RLCHBS

Nhiều bệnh di truyền thiếu hụt các enzym dị hóa acid amin gây tăng một hoặc nhiều acid amin trong máu. Nồng độ các acid amin trong máu tăng cao có thể gây acid amin niệu. Một số bệnh di truyền tổn thương khả năng tái hấp thu ở thận gây acid amin niệu trong khi nồng độ các acid amin đó trong máu bình thường hoặc thấp. Một số RLCHBS có liên quan đến acid amin thường gặp là bệnh phenylceton niệu, rối loạn chuyển hóa acid amin mạch nhánh (MSUD), bệnh tăng citrulline máu (citrullinemia) typ I và II.

Để chẩn đoán RLC BS acid amin, việc định danh được rối loạn đó xảy ra ở nhóm acid amin nào, mức độ ra sao thì bằng chứng quan trọng nhất là kết quả phân tích acid amin trong máu và nước tiể . Từ đó giúp khẳng đ nh hoặc

loại trừ giả thiết ban đầu, đồng thời định hướng tới các xét nghiệm di truyền chuyên sâu như phân tích gen để xác định đột biến gây nên bệnh lý.

1 5. Tình hình nghiên cứu về phân tích acid amin bằng phương pháp UPLC

Trên thế giớ : Phương pháp UPLC ra đời từ năm 2004, cho tới nay đã

gần một thập kỷ. Với n ững ưu thế của mình, UPLC đã dần thay thế cho HPLC để góp phần vào các nghiên cứu và các ứng dụng trong hóa phân tích. Đã có nhiều bài báo được đăng trên các tạp chí khoa học uy tín trên tồn thế giới về UPLC trong phân tích acid amin

Đơn giản nhất là hệ thống UPLC với đầu dị U /VIS ở bước sóng 260 nm. Năm 2011, Srinivas B. Narayan và cộng sự đã công bố nghiên cứu về định lượng acid amin huyết tương bằng UPLC- UV/VIS với dẫn xuất tiền cột bằng 6- aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. Thể tích mẫu dùng cho phân tích là 100 µL, mẫu được loại protein bằng dung dịch SSA 10%, chuẩn nội là norvaline. Thời gian chạy cho mỗi mẫu là 45 phút. Phương pháp được dựng để so sánh với UPLC là sắc ký trao đổi ion. Nghiên cứu này đã đánh giá UPLC là một phương pháp hiệu quả giúp đưa ra được đánh giá khái quát nhất về các thành phần acid amin trong máu. Ơng đề cao tính đơn giản-hiệu quả của hệ thống UPLC-UV/VIS. Không thể phủ nhận sự tối tân trong phương pháp phát hiện bằng hệ thống khối phổ hai lần MS/MS, nhưng UPLC-MS/MS lại là phương pháp khá phức tạp và tốn kém đặc biệt là với các khoa xét nghiệm hóa sinh lâm sàng

Theo nghiên cứu của W.A. Huub Waterval và cợng sự (2009 : phân tích định lượng acid amin khơng dẫn xuất hóa trong dịch cơ thể bằng UPLC-M /MS là một cơng cụ tin cậy trong chẩn đốn và theo dõi RLCHBS. Kết quả phân tích acid amin trong máu và nước tiểu thu trong vịng 30 phút và có mối tương quan rất chặt chẽ với phương pháp sắc ký trao đổi ion

Ở Việt Na , theo các đề tài đã được cơng bố thì ứng dụng phân tích

acid amin bằng phương pháp UPL -TUV hoặc UPLC-MS/MS chủ yếu được áp dụng trong các lĩnh vực chính nh : cơng nghệ thực phẩm, ni trồng thủy hải sả . Hiện tại ở ViệtNam , chưa có nghiên cứu nào về phân tích acid amin trong máu và nước tiểu bằng phương pháp UPL

Điểm qua một vài nghiên cứu về acid amin bằng phương pháp UPLC trên thế giới, có thể thấy phương pháp UPLC đang dần thay thế cho HPLC. UPLC đã vượt qua được những giới hạn trước đây để trở thành phương pháp ưu việt so với các kỹ thuật khác. Ở nước t , UPLC vẫn còn là kỹ thuật mới mẻ, các nghiên cứu chủ yếu sử dụng phương pháp HPLC , HPLC-MS/MS.

C ương

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ

2.1. Chất liệu và đối tượng nghiên cứ