3. Yờu cầu của đề tài
2.2.2.2. Nghiờn cứu đặc điểm sinh sản hữu tớnh liờn quan đến quỏ trỡnh thụ
trưởng của ụng phấn trong nhụy hoa. Thớ nghiệm xỏc định thời gian thụ tinh, sinh trưởng của ống phấn liờn quan đến quỏ trỡnh tự thụ và giao phấn.
c - Thử nghiệm khả năng cho tạo quả và tạo hạt với cỏc thớ nghiệm bao hoa (ngăn cản quỏ trỡnh giao phấn với việc hỡnh thành quả).
2.2.1.3. Nghiờn cứu khả năng duy trỡ sinh sản hữu tớnh liờn quan đến sự nảy mầm và bảo quản hạt phấn nảy mầm và bảo quản hạt phấn
- Nghiờn cứu khả năng nẩy mầm của hạt phấn - Nghiờn cứu khả năng bảo quản hạt phấn
2.2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.2.2.1. Nghiờn cứu đặc điểm của hiện tƣợng đa phụi liờn quan đến sinh sản hữu tớnh
Mỗi dũng giống điều tra thu 5-10 quả, thu toàn bộ hạt, loại bỏ hạt lộp, hạt khụng hoàn thiện, kiểm tra ngẫu nhiờn 200 hạt trong số hạt hoàn thiện. Sau đú búc vỏ, kiểm tra, phõn loại số lượng hạt đa phụi, đơn phụi và xỏc định tỷ lệ hạt đơn phụi và đa phụi.
Trờn mỗi giống cú hạt đa phụi, đếm số phụi của 100 hạt đa phụi và xỏc định số phụi trung bỡnh/hạt.
2.2.2.2. Nghiờn cứu đặc điểm sinh sản hữu tớnh liờn quan đến quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụ phấn thụ tinh
a) Phương phỏp xỏc định khả năng tạo quả và hạt với quỏ trỡnh thụ phấn khỏc nhau (tự thụ phấn và giao phấn với cỏc nguồn hạt phấn khỏc nhau):
nhau, cỏc dũng giống tự thụ và giao phấn trung bỡnh trờn 25 hoa cho một tổ hợp thụ phấn, sau khi quả chớn tiờn hành thu quả và đỏnh giỏ.
b) Phương phỏp nghiờn cứu quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụng qua quan sỏt sinh trưởng của ụng phấn trong nhụy hoa
- Phương phỏp lai tạo (dựng cho điểm a, b của tiểu mục 2.2.1.2) + Phương phỏp thu nhận hạt phấn: Hạt phấn được thu hỏi từ hoa sắp nở, trước khi hoa nở 1 - 2 ngày thu hỏi hoa; tiến hành mở cỏnh hoa loại bỏ nhuỵ, đặt hoa trong đĩa petri đảm bảo thụng thoỏng khớ, để trong điều kiện phũng thớ nghiệm hoặc nơi thoỏng mỏt, trỏnh bị nhiễm hạt phấn lạ, khi bao phấn nở tiến hành thụ phấn trực tiếp hoặc bảo quản trong nhiệt độ 5oC để cú thể thụ phấn muộn hơn.
+ Phương phỏp tự thụ: Trờn cõy cam quýt thớ nghiệm, chọn những hoa sắp nở (trước khi nở 1- 2 ngày) cỏnh hoa chưa mở, tiến hành loại bỏ cỏnh hoa, khử đực bằng cỏch loại bỏ bao phấn, sau đú thụ phấn nhõn tạo bằng cỏch quột bao phấn (hoa của chớnh cõy đú đó chuẩn bị) lờn đầu nhuỵ của hoa, nhanh chúng cỏch ly hoa đó thụ phấn bằng cỏch bọc hoa trong tỳi lai tạo chuyờn dụng và đỏnh dấu nhận biết.
+ Phương phỏp thụ phấn chộo: Trờn cõy cam quýt thớ nghiệm, chọn những hoa sắp nở (trước khi nở 1 - 2 ngày) khi cỏnh hoa chưa mở, tiến hành loại bỏ cỏnh hoa, khử đực bằng cỏch loại bỏ bao phấn, sau đú thụ phấn nhõn tạo bằng cỏch quột bao phấn (của giống khỏc đó chuẩn bị) lờn đầu nhuỵ của hoa, nhanh chúng cỏch ly hoa đó thụ phấn bằng cỏch bọc hoa trong tỳi lai tạo chuyờn dụng; trờn bao cỏch ly cú đỏnh dấu nhận biết.
+ Thu thập mẫu thớ nghiệm
Đối với cỏc mẫu thớ nghiệm theo dừi sự sinh trưởng của ống phấn thỡ thu mẫu sau 1, 2, 4, 6, 8 ngày.
thỡ sau 12 - 15 ngày thỏo bỏ tỳi cỏch ly và đỏnh dấu quả được lai tạo. Theo dừi đến khi quả chớn thu toàn bộ quả, đếm số quả, búc quả thu hạt đếm số hạt, xỏc định tỷ lệ đậu quả và số hạt trung bỡnh trờn quả.
Hoa được thụ phấn với cỏc nguồn hạt phấn khỏc nhau, tiến hành thu hoa trong cỏc khoảng thời gian 1, 2, 4, 6, 8 ngày sau thụ phấn. Xử lý mẫu và quan sỏt sinh trưởng của ống phấn như sau:
+ Phương phỏp cắt hoa để quan sỏt sinh trưởng của ống phấn trong nhụy hoa: Để thuận lợi cho việc quan sỏt, nhụy hoa (gồm cả bầu hoa) được cắt theo 5 phần riờng biệt từ theo sơ đồ dưới đõy:
Phần cắt 1: Phần đầu nhụy hoa Phần cắt 2: Vị trớ 1/3 phớa trờn vũi nhụy phần tiếp giỏp với đầu nhụy hoa
Phần cắt 3: Vớ trớ 1/3 phớa giữa vũi nhụy
Phần cắt 4: Vớ trớ 1/3 phớa dưới vũi nhụy phần tiếp giỏp với bầu nhụy hoa
Phần cắt 5: Bầu nhụy hoa
Ký hiệu: SM (stigma) Ký hiệu: UP (Upper Style) Ký hiệu: MS (Middle Style) Ký hiệu: LS (Lower Style) Ký hiệu: OV (Ovary) + Phương phỏp xử lý mẫu để quan sỏt sinh trưởng của ống phấn trong vũi nhuỵ và sự thụ tinh: Hoa thụ phấn được thu nhận được xử lý trong dung dịch acid acetic và rượu ethanol (tỷ lệ 1:3). Sau 24 – 48 giờ rửa sạch và bảo quản trong ethanol 70% ở 4ºC cho đến khi sử dụng. Khi quan sỏt, cắt mỗi nhuỵ hoa thành năm phần (như đó trỡnh bày ở trờn): Đầu nhuỵ, vũi nhuỵ cắt làm 3 phần (đầu vũi nhuỵ, giữa vũi nhuỵ, cuối vũi nhuỵ) và bầu. Mẫu được được làm mềm bằng cỏch nhỳng ngập trong sodiumhydroxide N 0,6 - 0,8 khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phũng, rửa lại bằng nước cất và nhuộm màu với anilin 0,2% màu xanh để trong 0.1M phosphate kali khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phũng. Sau đú quan sỏt bằng kớnh hiển vi huỳnh quang bước súng từ 260- 500nm [40], [41].
(ngăn cản quỏ trỡnh giao phấn với việc hỡnh thành quả): Trờn cơ sở thớ nghiệm ở điểm a, b nội dung 2.2.1.2 lựa chọn cỏc dũng giống đại diện cho hai nhúm cú/khụng cú khả năng đậu quả và cú/khụng cú hạt khi cho tự thụ để làm thớ nghiệm. Trước khi hoa nở 1-2 ngày, cỏc hoa thớ nghiệm được bao quả bằng tỳi chuyờn dụng để ngăn cản khụng cho qua trỡnh thụ phấn xẩy ra. Nghĩa là sau khi hoa nở trong tỳi bao thỡ chỉ cú quỏ trỡnh tự thụ xẩy ra. Bao hoa cho đến sau khi hoa nở 15 ngày tiến hành thỏo bao hoa, đỏnh dấu quả, thu hỏi quả chớn và tiến hành đỏnh giỏ.
2.2.2.3. Nghiờn cứu khả năng duy trỡ sinh sản hữu tớnh liờn quan đến sự nảy mầm và bảo quản hạt phấn nảy mầm và bảo quản hạt phấn
- Phương phỏp đỏnh giỏ sự nẩy mầm của hạt phấn: Thu hạt phấn ở những hoa bắt đầu nở, gieo hạt phấn trờn mụi trường agar (Một lớt mụi trường cần hoà 20 mg axit boric, 20g đường và 7g agar; pha mụi trường, đun sụi để nguội, đổ ra cỏc đĩa petri mỏng khoảng 1 – 2mm, lắc nhẹ để phấn hoa rơi đều trờn đĩa petri đường kớnh 8cm. Sau 12 giờ đưa mẫu soi trực tiếp trờn kớnh hiển vi. Khoanh vựng cỏc vựng gieo hạt phấn cú thể đếm được, đếm tổng số hạt phấn và tống số hạt phấn nầy mầm và tớnh tỷ lệ nầy mầm.
- Phương phỏp nghiờn cứu bảo quản hạt phấn: Hoa của cõy thớ nghiệm được thu hỏi khi bắt đầu hoặc chuẩn bị nở (1-2 ngày trước khi nở hoa). Tiến hành bảo quản hoa trong điều kiện nhiệt độ lạnh 5oC, đỏnh giỏ khả năng nẩy mầm của hạt phấn sau cỏc khoảng thời gian: 10, 20, 30, 40 ngày.