3. Yờu cầu của đề tài
2.1.2. Thời gian nghiờn cứu
Đề tài được tiến hành từ thỏng 10/2010 đến thỏng 9/2012.
2.2. Nội dung, phƣơng phỏp và chỉ tiờu nghiờn cứu 2.2.1. Nội dung nghiờn cứu
2.2.1.1. Nghiờn cứu đặc điểm của hiện tượng đa phụi của một số dũng, giống cam quýt
- Xỏc định cỏc giống cam quýt cú hạt đa phụi - Xỏc định cỏc giống cam quýt cú hạt đơn phụi
- Xỏc định cỏc giống cam quýt cú hạt đơn phụi và đa phụi và tỷ lệ hạt đơn phụi, đa phụi.
- Xỏc định số phụi/hạt của cỏc giống cam quýt cú hạt đa phụi
2.2.1.2. Nghiờn cứu đặc điểm sinh sản hữu tớnh liờn quan đến quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh
Quỏ trỡnh sinh sản hữu tớnh liờn quan chặt chẽ đến thụ phấn thu tinh, trong đú liờn quan đến sự kộo dài của ống phấn (mang theo giao tử đực) trong
nội dung sau:
a - Xỏc định khả năng tạo quả và hạt với quỏ trỡnh thụ phấn khỏc nhau. Thớ nghiệm nhằm xỏc định ảnh hưởng của nguồn hạt phấn khỏc nhau đến khả năng tạo hạt, đậu quả và năng suất quả ở cỏc dũng, giống thớ nghiệm thuộc họ cam quýt; xỏc định tương quan giữa số hạt/quả và trọng lượng quả của một số giống, dũng thớ nghiệm.
b - Nghiờn cứu quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụng qua quan sỏt sinh trưởng của ụng phấn trong nhụy hoa. Thớ nghiệm xỏc định thời gian thụ tinh, sinh trưởng của ống phấn liờn quan đến quỏ trỡnh tự thụ và giao phấn.
c - Thử nghiệm khả năng cho tạo quả và tạo hạt với cỏc thớ nghiệm bao hoa (ngăn cản quỏ trỡnh giao phấn với việc hỡnh thành quả).
2.2.1.3. Nghiờn cứu khả năng duy trỡ sinh sản hữu tớnh liờn quan đến sự nảy mầm và bảo quản hạt phấn nảy mầm và bảo quản hạt phấn
- Nghiờn cứu khả năng nẩy mầm của hạt phấn - Nghiờn cứu khả năng bảo quản hạt phấn
2.2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.2.2.1. Nghiờn cứu đặc điểm của hiện tƣợng đa phụi liờn quan đến sinh sản hữu tớnh
Mỗi dũng giống điều tra thu 5-10 quả, thu toàn bộ hạt, loại bỏ hạt lộp, hạt khụng hoàn thiện, kiểm tra ngẫu nhiờn 200 hạt trong số hạt hoàn thiện. Sau đú búc vỏ, kiểm tra, phõn loại số lượng hạt đa phụi, đơn phụi và xỏc định tỷ lệ hạt đơn phụi và đa phụi.
Trờn mỗi giống cú hạt đa phụi, đếm số phụi của 100 hạt đa phụi và xỏc định số phụi trung bỡnh/hạt.
2.2.2.2. Nghiờn cứu đặc điểm sinh sản hữu tớnh liờn quan đến quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụ phấn thụ tinh
a) Phương phỏp xỏc định khả năng tạo quả và hạt với quỏ trỡnh thụ phấn khỏc nhau (tự thụ phấn và giao phấn với cỏc nguồn hạt phấn khỏc nhau):
nhau, cỏc dũng giống tự thụ và giao phấn trung bỡnh trờn 25 hoa cho một tổ hợp thụ phấn, sau khi quả chớn tiờn hành thu quả và đỏnh giỏ.
b) Phương phỏp nghiờn cứu quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụng qua quan sỏt sinh trưởng của ụng phấn trong nhụy hoa
- Phương phỏp lai tạo (dựng cho điểm a, b của tiểu mục 2.2.1.2) + Phương phỏp thu nhận hạt phấn: Hạt phấn được thu hỏi từ hoa sắp nở, trước khi hoa nở 1 - 2 ngày thu hỏi hoa; tiến hành mở cỏnh hoa loại bỏ nhuỵ, đặt hoa trong đĩa petri đảm bảo thụng thoỏng khớ, để trong điều kiện phũng thớ nghiệm hoặc nơi thoỏng mỏt, trỏnh bị nhiễm hạt phấn lạ, khi bao phấn nở tiến hành thụ phấn trực tiếp hoặc bảo quản trong nhiệt độ 5oC để cú thể thụ phấn muộn hơn.
+ Phương phỏp tự thụ: Trờn cõy cam quýt thớ nghiệm, chọn những hoa sắp nở (trước khi nở 1- 2 ngày) cỏnh hoa chưa mở, tiến hành loại bỏ cỏnh hoa, khử đực bằng cỏch loại bỏ bao phấn, sau đú thụ phấn nhõn tạo bằng cỏch quột bao phấn (hoa của chớnh cõy đú đó chuẩn bị) lờn đầu nhuỵ của hoa, nhanh chúng cỏch ly hoa đó thụ phấn bằng cỏch bọc hoa trong tỳi lai tạo chuyờn dụng và đỏnh dấu nhận biết.
+ Phương phỏp thụ phấn chộo: Trờn cõy cam quýt thớ nghiệm, chọn những hoa sắp nở (trước khi nở 1 - 2 ngày) khi cỏnh hoa chưa mở, tiến hành loại bỏ cỏnh hoa, khử đực bằng cỏch loại bỏ bao phấn, sau đú thụ phấn nhõn tạo bằng cỏch quột bao phấn (của giống khỏc đó chuẩn bị) lờn đầu nhuỵ của hoa, nhanh chúng cỏch ly hoa đó thụ phấn bằng cỏch bọc hoa trong tỳi lai tạo chuyờn dụng; trờn bao cỏch ly cú đỏnh dấu nhận biết.
+ Thu thập mẫu thớ nghiệm
Đối với cỏc mẫu thớ nghiệm theo dừi sự sinh trưởng của ống phấn thỡ thu mẫu sau 1, 2, 4, 6, 8 ngày.
thỡ sau 12 - 15 ngày thỏo bỏ tỳi cỏch ly và đỏnh dấu quả được lai tạo. Theo dừi đến khi quả chớn thu toàn bộ quả, đếm số quả, búc quả thu hạt đếm số hạt, xỏc định tỷ lệ đậu quả và số hạt trung bỡnh trờn quả.
Hoa được thụ phấn với cỏc nguồn hạt phấn khỏc nhau, tiến hành thu hoa trong cỏc khoảng thời gian 1, 2, 4, 6, 8 ngày sau thụ phấn. Xử lý mẫu và quan sỏt sinh trưởng của ống phấn như sau:
+ Phương phỏp cắt hoa để quan sỏt sinh trưởng của ống phấn trong nhụy hoa: Để thuận lợi cho việc quan sỏt, nhụy hoa (gồm cả bầu hoa) được cắt theo 5 phần riờng biệt từ theo sơ đồ dưới đõy:
Phần cắt 1: Phần đầu nhụy hoa Phần cắt 2: Vị trớ 1/3 phớa trờn vũi nhụy phần tiếp giỏp với đầu nhụy hoa
Phần cắt 3: Vớ trớ 1/3 phớa giữa vũi nhụy
Phần cắt 4: Vớ trớ 1/3 phớa dưới vũi nhụy phần tiếp giỏp với bầu nhụy hoa
Phần cắt 5: Bầu nhụy hoa
Ký hiệu: SM (stigma) Ký hiệu: UP (Upper Style) Ký hiệu: MS (Middle Style) Ký hiệu: LS (Lower Style) Ký hiệu: OV (Ovary) + Phương phỏp xử lý mẫu để quan sỏt sinh trưởng của ống phấn trong vũi nhuỵ và sự thụ tinh: Hoa thụ phấn được thu nhận được xử lý trong dung dịch acid acetic và rượu ethanol (tỷ lệ 1:3). Sau 24 – 48 giờ rửa sạch và bảo quản trong ethanol 70% ở 4ºC cho đến khi sử dụng. Khi quan sỏt, cắt mỗi nhuỵ hoa thành năm phần (như đó trỡnh bày ở trờn): Đầu nhuỵ, vũi nhuỵ cắt làm 3 phần (đầu vũi nhuỵ, giữa vũi nhuỵ, cuối vũi nhuỵ) và bầu. Mẫu được được làm mềm bằng cỏch nhỳng ngập trong sodiumhydroxide N 0,6 - 0,8 khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phũng, rửa lại bằng nước cất và nhuộm màu với anilin 0,2% màu xanh để trong 0.1M phosphate kali khoảng 24 giờ ở nhiệt độ phũng. Sau đú quan sỏt bằng kớnh hiển vi huỳnh quang bước súng từ 260- 500nm [40], [41].
(ngăn cản quỏ trỡnh giao phấn với việc hỡnh thành quả): Trờn cơ sở thớ nghiệm ở điểm a, b nội dung 2.2.1.2 lựa chọn cỏc dũng giống đại diện cho hai nhúm cú/khụng cú khả năng đậu quả và cú/khụng cú hạt khi cho tự thụ để làm thớ nghiệm. Trước khi hoa nở 1-2 ngày, cỏc hoa thớ nghiệm được bao quả bằng tỳi chuyờn dụng để ngăn cản khụng cho qua trỡnh thụ phấn xẩy ra. Nghĩa là sau khi hoa nở trong tỳi bao thỡ chỉ cú quỏ trỡnh tự thụ xẩy ra. Bao hoa cho đến sau khi hoa nở 15 ngày tiến hành thỏo bao hoa, đỏnh dấu quả, thu hỏi quả chớn và tiến hành đỏnh giỏ.
2.2.2.3. Nghiờn cứu khả năng duy trỡ sinh sản hữu tớnh liờn quan đến sự nảy mầm và bảo quản hạt phấn nảy mầm và bảo quản hạt phấn
- Phương phỏp đỏnh giỏ sự nẩy mầm của hạt phấn: Thu hạt phấn ở những hoa bắt đầu nở, gieo hạt phấn trờn mụi trường agar (Một lớt mụi trường cần hoà 20 mg axit boric, 20g đường và 7g agar; pha mụi trường, đun sụi để nguội, đổ ra cỏc đĩa petri mỏng khoảng 1 – 2mm, lắc nhẹ để phấn hoa rơi đều trờn đĩa petri đường kớnh 8cm. Sau 12 giờ đưa mẫu soi trực tiếp trờn kớnh hiển vi. Khoanh vựng cỏc vựng gieo hạt phấn cú thể đếm được, đếm tổng số hạt phấn và tống số hạt phấn nầy mầm và tớnh tỷ lệ nầy mầm.
- Phương phỏp nghiờn cứu bảo quản hạt phấn: Hoa của cõy thớ nghiệm được thu hỏi khi bắt đầu hoặc chuẩn bị nở (1-2 ngày trước khi nở hoa). Tiến hành bảo quản hoa trong điều kiện nhiệt độ lạnh 5oC, đỏnh giỏ khả năng nẩy mầm của hạt phấn sau cỏc khoảng thời gian: 10, 20, 30, 40 ngày.
2.2.3. Chỉ tiờu nghiờn cứu
2.2.3.1. Nghiờn cứu đặc điểm của hiện tƣợng đa phụi của một số dũng, giống thuộc họ cam quýt
- Tỷ lệ hạt đa phụi:
Số hạt đa phụi
Tỷ lệ hạt đa phụi (%) = x 100
Số hạt đơn phụi
Tỷ lệ hạt đơn phụi (%) = x 100 Số hạt quan sỏt
- Tớnh trung bỡnh số phụi trong 1 hạt:
Tổng số phụi quan sỏt Trung bỡnh phụi/hạt (phụi/hạt) =
Tổng số hạt quan sỏt
2.2.3.2. Nghiờn cứu đặc điểm sinh sản hữu tớnh liờn quan đến quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụ phấn thụ tinh
a) Chi tiờu nghiờn cứu xỏc định khả năng tạo quả và hạt với quỏ trỡnh thụ phấn khỏc nhau
+ Tỷ lệ quả đậu (%)
Số quả đậu đến khi chớn
Tỷ lệ đậu quả (%) = x 100
Số mẫu hoa thụ phấn thu quả + Trung bỡnh số hạt trờn quả
Tổng số hạt thu được
Trung bỡnh số hạt trờn quả (hạt/quả) = Tổng số quả quan sỏt + Xỏc định tương quan giữa số hạt và trọng lượng quả.
b) Chỉ tiờu nghiờn cứu quỏ trỡnh thụ phấn thụ tinh thụng qua quan sỏt sinh trưởng của ụng phấn trong nhụy hoa
Số lượng ống phấn tại cỏc vị trớ: Đỉnh nhụy (nỳm nhụy); 1/3 phớa trờn vũi nhụy; 1/3 phớa giữa vũi nhụy; 1/3 phớa dưới vũi nhụy và ở trong bầu hoa.
c) Chỉ tiờu thử nghiệm khả năng tạo quả và hạt với cỏc thớ nghiệm bao hoa (ngăn cản quỏ trỡnh giao phấn với việc hỡnh thành quả)
đến sự nảy mầm và bảo quản hạt phấn Độ nảy mầm của hạt phấn: Số hạt phấn nảy mầm Tỷ lệ hạt phấn nảy mầm (%) = x 100 Tổng số hạt phấn đếm được 2.2.4. Phƣơng phỏp xử lớ số liệu
Số liệu được xử lớ bằng cỏc phần mềm chuyờn dụng (Irristat, exel... ) và cỏc phương phỏp thống kờ toỏn học.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiờn cứu hiện tƣợng đa phụi của một số dũng, giống thuộc họ cam quýt
3.1.1. Nghiờn cứu tỷ lệ hạt đa phụi của một số dũng, giống thuộc họ cam quýt 3.1.1.1. Khả năng mang hạt đa phụi của một số dũng, giống bƣởi 3.1.1.1. Khả năng mang hạt đa phụi của một số dũng, giống bƣởi
Nghiờn cứu đặc điểm phụi hạt của một số dũng, giống bưởi năm 2011, chỳng tụi thu được kết quả thể hiện dưới bảng 3.1:
Bảng 3.1: Tỷ lệ đa phụi ở một số dũng, giống bƣởi Dũng/giống Tổng số hạt
điều tra
Tỷ lệ đa phụi Tỷ lệ đơn phụi Số hạt đa phụi Tỷ lệ (%) Số hạt đơn phụi Tỷ lệ (%) Diễn 200 0 0 200 100 Phỳc Trạch 200 0 0 200 100 Da xanh 200 0 0 200 100 Năm Roi 200 0 0 200 100 2XB 200 0 0 200 100 TN2 200 0 0 200 100 TN3 200 0 0 200 100 TN4 200 0 0 200 100 TN5 200 0 0 200 100 TN8 200 0 0 200 100 TN9 200 0 0 200 100 TN10 200 0 0 200 100 TN11 200 0 0 200 100 TN14 200 0 0 200 100 TN15 200 0 0 200 100 TN16 200 0 0 200 100 TN18 200 0 0 200 100 TN19 200 0 0 200 100 TN20 200 0 0 200 100
Nghiờn cứu về đặc điểm đa phụi của cõy cú mỳi, nhiều cụng trỡnh đó xỏc định cú những giống cú 100% số hạt là đa phụi hoặc đơn phụi, cú giống hạt đa phụi chỉ chiếm một tỷ lệ nhất định. Do vậy, cỏc giống cõy cú mỳi được chia thành giống đơn phụi và giống đa phụi. Cỏc giống đa phụi cũng rất khỏc
chỉ cú một tỷ lệ nhỏ hạt là đa phụi.
Số liệu tại bảng 3.1 cho thấy cỏc giống, dũng bưởi khỏc nhau trong nghiờn cứu đều cho 100% số hạt đơn phụi. Phụi của chỳng là phụi hữu tớnh được hỡnh thành do sự sắp xếp lại bộ gen của bố và mẹ . Cỏc dũng, giống bưởi được nghiờn cứu là dũng, giống đơn phụi.
3.1.1.2. Khả năng mang hạt đa phụi của một số dũng, giống cam quýt
Để xỏc định được dũng, giống cam, quýt chỉ mang hạt đa phụi, chỉ mang hạt đơn phụi hay mang cả hạt đa phụi và hạt đơn phụi, chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm xỏc định tỷ lệ hạt đa phụi, đơn phụi và thu được kết quả thể hiện trong bảng số liệu 3.2:
Bảng 3.2: Tỷ lệ đa phụi ở một số dũng, giống cam và quýt Tờn giống hạt điều Tổng số
tra
Tỷ lệ hạt đa phụi Tỷ lệ hạt đơn phụi Số hạt đa phụi Tỷ lệ Số hạt đơn phụi Tỷ lệ TN1 200 57 28,5 143 71,5 TN6 200 85 42,5 115 57,5 TN12 200 9 4,5 191 95,5 TN13 200 9 4,5 191 95,5 TN18 200 200 100,0 0 0,0 XB-1 200 197 98,5 3 1,5 XB-2 200 200 100,0 0 0,0 XB-3 200 199 99,5 1 0,5 XB-4 200 199 99,5 1 0,5 XB-5 200 200 100,0 0 0,0 XB-6 200 200 100,0 0 0,0 Cam V2 200 125 62,5 75 37,5
Cam Tuyờn Quang 200 149 74,5 51 25,5
Cam Vinh 200 199 99,5 1 0,5
Cam Đường Canh 200 200 100,0 0 0,0
Quýt Bắc Kạn 200 200 100,0 0 0,0
cam dao động từ 0 - 100% tổng số hạt. Tỷ lệ hạt đơn phụi cú khoảng dao động từ 0 - 95,5% tổng số hạt.
Trong đú cam Đường canh, quýt Bắc Kạn, quýt Bắc Sơn và dũng cam TN18, XB-2, XB-5, XB-6 cho 100% số hạt đa phụi nờn chỳng là dũng, giống đa phụi. Trong hạt đa phụi, những phụi vụ tớnh nảy mầm thành cõy khỏe hơn và cú khuynh hướng giống cõy mẹ nhiều hơn nờn khi lai tạo giống, cỏc con lai yếu và thường chết gõy khú khăn cho chọn tạo và chăm súc cõy lai. Cỏc giống, dũng này chỉ nờn ứng dụng làm gốc ghộp trong sản xuất cõy giống.
Cam Vinh, dũng cam XB-1, XB-3, XB-4 cho 98,5 - 99,5% số hạt đa phụi và 0,5 - 1,5% số hạt đơn phụi. Cỏc dũng, giống cam này mang cả hạt đơn phụi và hạt đa phụi trong đú đa số là hạt đa phụi.
Cam Sành Tuyờn Quang cho 74,5% số hạt đa phụi và 25,5% hạt đơn phụi; cam V2 cho 62,5% lượng hạt đa phụi và 37,5% số hạt đơn phụi. Đõy là dũng và giống cam vừa cho hạt đa phụi vừa cho hạt đơn phụi trong đú tỷ lệ hạt đa phụi cao hơn.
Cỏc dũng cam TN1, TN6, TN12, TN13 cú tỷ lệ hạt đa phụi thấp, đặc biệt là dũng TN12 và dũng TN13 chỉ mang 4,5% hạt đa phụi với 95,5% số hạt đơn phụi. Cỏc dũng cam này mang cả hạt đơn phụi và hạt đa phụi trong đú hạt đơn phụi chiếm tỷ lệ lớn nờn chỳng cú khả năng sinh sản hữu tớnh tốt nhất trong số cỏc dũng, giống cam được nghiờn cứu. Chỳng ta cú thể sử dụng cỏc dũng, giống này làm cõy mẹ trong lai tạo giống.
3.1.2. Nghiờn cứu số phụi trong hạt của một số dũng, giống thuộc họ cam quýt mang hạt đa phụi quýt mang hạt đa phụi
Hiện tượng đa phụi ở cõy cú mỳi đó được nhiều tỏc giả nghiờn cứu. Số phụi trung bỡnh trờn một hạt phụ thuộc chặt chẽ vào giống (genotype) và điều kiện gieo trồng. Cỏc giống khỏc nhau cú số lượng phụi khỏc nhau. Thụng thường trong một hạt cú thể cú đến từ 2 đến 3, đụi khi 4 phụi thậm chớ 7 phụi. Nghiờn cứu về số lượng phụi trong hạt của cỏc dũng, giống thuộc họ cam quýt cú hạt đa phụi chỳng tụi thu được kết quả thể hiện tại bảng 3.3:
Dũng/Giống (a) Số lƣợng hạt
điều tra (hạt) Tổng số phụi (phụi) Số phụi/hạt
TN1 100 245 2,45 TN6 100 223 2,23 TN18 100 356 3,56 XB-1 100 305 3,05 XB-2 100 370 3,70 XB-3 100 389 3,89 XB-4 100 302 3,02 XB-5 100 285 2,85 XB-6 100 356 3,56 Cam V2 100 255 2,55
Cam Tuyờn Quang 100 315 3,15
Cam Vinh 100 298 2,98
Cam Đường Canh 100 365 3,65
Quýt Bắc Kạn 100 275 2,75
Quýt Bắc Sơn 100 301 3,01
(a)
Ghi chỳ: Chỉ điều tra ở hạt đa phụi
Bảng 3.3 cho thấy: Cỏc dũng, giống cam khỏc nhau cho số lượng phụi trung bỡnh/hạt khỏc nhau và dao động từ 2-4 phụi/hạt. Giống, dũng cú trung bỡnh số phụi trờn hạt càng cao thỡ khả năng sinh sản hữu tớnh càng yếu. Khả năng sinh sản hữu tớnh của cỏc dũng, giống cam giảm dần: Dũng TN6> dũng TN1> dũng V2 > quýt Bắc Kạn> dũng XB-5> cam Vinh>quýt Bắc Sơn> dũng XB-4> dũng XB-1> cam Tuyờn Quang > dũng TN18, dũng XB-6> cam