Các phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật

1.4.2.1. Các phương pháp gieo cấy

a. Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác

 Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút.

 Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường.

 Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy.

 Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra.

 Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.

 Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống.

 Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.

 Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.  Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.

 Chú ý:

• Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay que cấy.

• Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ ống hút sau khi đã tháo giấy bao gói.

b. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.

 Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên.  Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo:

+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:  Hình chữ chi

 Hình vòng xoắn

 Hình vạch ngang song song

c. Phương pháp cấy trên thạch đứng

Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí.  Sử dụng que cấy hình kim.

 Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ.

 Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu.

 Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường.

d. Phương pháp cấy trên đĩa petri

Có thể cấy trên đĩa petri theo 1 trong 2 cách sau:

 Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:  Để đĩa petri lên bàn.

 Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp chung.

 Tay trái hé mở nắp đĩa petri vừa đủ để cho que cấy vào.

 Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:

+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch + Theo những đường song song

+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc

 Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy một lượng khá nhiều giống. Có 2 cách:

 Cách 1:

+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 50°C.

+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường. + Đổ thạch này vào đĩa petri đã khử trùng.

+ Xoay tròn đĩa petri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.

+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.  Cách 2:

+ Hút 0,1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa petri có môi trường đặc. + Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch.

+ Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loài vi sinh vật.

1.4.2.2. Các phương pháp nuôi vi sinh vật

Để đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện nuôi dưỡng chúng. Các điều kiện đó bao gồm:

 Nhiệt độ: Tuỳ loài vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó.

 Độ ẩm: Để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi cần: + Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường.

+Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm.

 Ôxi:

Đối với vi sinh vật hiếu khí:

+ Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2.

+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải.

+ Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật.

+ Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ.

Đối với vi sinh vật kị khí: Hạn chế sự tiếp xúc với oxi bằng cách đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin hoặc cấy trích sâu vào môi trường đặc.

Nuôi cấy trong bình hút chân không. Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại. Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2.

Để nguội 45°C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2.

 Kết quả của việc nuôi cấy:

Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy:  Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường.

 Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng:

+ Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục.

+ Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy.

 Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột môi trường.

Chương II:

VẬT LIỆU VÀ

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguồn nguyên liệu 2.1.1. Nguồn nguyên liệu

2.1.1.1. Nguyên liệu chính: Gạo lức

Gạo lức được thu mua tại chợ Đầm, Nha Trang. Gạo sử dụng cho thí nghiệm phải là gạo mới nhập về vì nếu gạo để quá lâu chất lượng sẽ giảm.

2.1.1.2. Nguyên liệu phụ a. Đường saccharose

Thu mua từ các công ty đường trong nước nên hầu như ổn định về nguồn hàng và vấn đề chất lượng được đảm bảo. Tuy nhiên để đảm bảo không có mối nguy nào bắt đầu từ các thành phần ban đầu tham gia hình thành nên sản phẩm thì được kiểm tra bằng cảm quan.

Đường dùng trong sản phẩm này là sản phẩm của công ty cổ phần đường Khánh hòa (địa chỉ: Suối Hiệp-Diên Khánh-Khánh Hòa-Việt Nam). Có các chỉ tiêu chất lượng sau:  Sac (độ pol) : ≥ 99,9  RS(%) : ≤ 0,03  W(%) : ≤ 0,04  Tro dẫn điện(%) : ≤ 0,02  Độ màu (IU) : ≤ 12  Dư lượng SO2 (ppm) : ≤ 5 b. Đường glucose

Là sản phẩm thủy phân của đường saccharose, ở dạng đơn nên vi khuẩn lactic dễ sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men. Vậy mục đích của việc bổ sung glucose là cung cấp một phần cơ chất cho sự lên men của vi khuẩn. Glucose được mua tại các cửa hàng hóa chất ở Nha Trang.

c. Nước

Nước sử dụng đạt tiêu chuẩn nước sử dụng trong sinh hoạt và trong các ngành thực phẩm (được cung cấp ở các nhà máy nước trong thành phố). Nước dùng cho sản phẩm thử nghiệm là nước tiệt trùng bằng tia cực tím tại trường đại học Nha Trang.

d. Pectin

Nguồn gốc:

Có mặt trong quả, củ, thân cây, đóng vai trò vận chuyển nước và lưu chất cho các trái cây đang trưởng thành, duy trì hình dáng và sự vững chắc của trái cây. Tiền thân của pectin là protopectin, không tan trong nước và có nhiều trong mô trái cây còn xanh. Quá trình chín sẽ kèm theo sự thủy phân protopectin thành pectin, sau đó kết hợp với sự demethyl hóa dưới tác dụng của enzyme và sự depolymer hóa của pectin tạo thành pectate và cuối cùng là các loại đường hòa tan và acid.

Cấu tạo:

Polysaccharide dị thể, mạch thẳng, là dẫn xuất methyl của acid pectic Acid pectic là 1 polymer của acid D-galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside. Một chuỗi gồm khoảng 10000 phân tử galactoronic tạo thành một phân tử pectin M=10000-100000.

Cấu tạo 1 đơn vị của chuỗi pectin (hình 2.1).

Pectin dùng cho sản phẩm được mua ở cửa hàng hóa chất, có dạng bột, màu trắng. Chỉ số quốc tế INS là E440.

Cách xử lý pectin trước khi bổ sung:

 Ngâm pectin vào nước lã với tỷ lệ nước/pectin = 19/1, ngâm trong thời gian 24 giờ để pectin hút nước trương nở.

 Sau đó đun nhẹ và khuấy trộn cho pectin tan ra rồi phối trộn vào dịch gạo lức và đồng hóa cho pectin phân bố đều trong dịch gạo.

e. Hương liệu

Là hỗn hợp rượu nước có chứa chất thơm dưới dạng tinh dầu dễ bay hơi, dễ bị oxi hoá dưói tác dụng của không khí.

Mục đích sử dụng để tạo hương thơm đặc trưng làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm, đồng thời tạo cảm giác ngon miệng cho người thưởng thức. Hương liệu bao gồm hương liệu tự nhiên, tổng hợp hoặc hỗn hợp.

Trong đề tài sử dụng hương liệu tổng hợp là tinh dầu cốm mua từ cửa hàng hoá chất tại Nha Trang.

f. Kalisorbat

Là muối Kali của axit sorbic và là chất bảo quản rất hiệu quả trong thực phẩm, có đặc điểm:

 Là chất bột màu trắng kết tinh, dễ tan trong nước.  Chỉ số INS: E202

 Công thức phân tử C5H7COOK  Khối lượng phân tử 150,22 g.mol-1  Điểm nóng chảy 270°C

 Khả năng tan trong nước 58.2% ở 20°C

Kalisorbat: lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được: 25 mg/kg cơ thể/ngày. Mức dùng thông thường: 0,05 – 0,1%.

Kalisorbat có tác dụng chống lại nấm mốc và các vi sinh vật nhằm kéo dài thời gian bảo quản.

Kalisorbat được công nhận là an toàn và không gây độc hại cho người, không gây mùi vị lạ khi cho vào thực phẩm.

Kalisorbat ít có tác dụng đối với vi khuẩn lactic, acetic.

g. Enzyme Termamyl 120L

Được sử dụng trong công đọan nấu chiết dịch gạo lức, là chế phẩm enzyme có chứa amylase đặc biệt chịu nhiệt. Enzyme này là endo-amylase, thủy phân liên kết 1,4-glucosid trong amylose và amylopectin. Vì thế tinh bột đã hồ hóa sẽ nhanh

chóng được chuyển thành các dextrin và oligosaccharide hòa tan, sau đó thành đường.

Termamyl được sử dụng trong sản xuất nhằm đường hóa tinh bột, thuận lợi cho quá trình lên men của vi khuẩn lactic.

 Liều lượng sử dụng: Liều lượng sử dụng là 0,25 – 1kg Termamyl cho mỗi tấn nguyên liệu phụ thuộc vào loại nguyên liệu nấu. Tức là lượng enzyme cho vào khoảng 0,025 – 0,1% so với nguyên liệu. Do không có điều kiện nghiên cứu về tỷ lệ enzyme nên em chọn tỷ lệ enzyme bổ sung vào là 0,1% so với bột gạo.

 Khoảng hoạt động tối ưu:  Nhiệt độ là 85-95°C  pH: 5,5 – 7

 Ca2+: 50 – 100ppm

 Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 2,5/1 – 4/1  Đặc điểm sản phẩm:

 Loại enzyme: Amylase.

 Màu sắc từ màu sáng đến nâu sẫm.  Trạng thái vật lý: lỏng.

 Tỷ trọng (g/ml): 1,26  Độ nhớt: 1 – 25

Sản phẩm tuân theo các tiêu chuẩn về độ tinh khiết đối với các enzyme dùng trong ngành thực phẩm được quy định bởi Ủy ban chuyên môn chung của FAO/WHO về Phụ gia Thực phẩm (JECFA) và Bộ luật về Hóa chất Thực phẩm (FCC).

h.Vi khuẩn lactic

Men được sử dụng là giống vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus và Streptococus

thermophilus.

Đặc điểm của 2 loại vi khuẩn trên là:  Hoạt động trong môi trường yếm khí  Phát triển tốt ở pH = 6,2 – 6,5

 Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng là 42 - 46°C  Bị ức chế khi acid đạt 2,2%

 Bị ức chế ở nhiệt độ < 10°C

 Chúng có khả năng lên men lactic đồng hình

Lactobacillus bulgaricus là vi khuẩn gram dương, hình que.

Streptococus thermophilus cũng là vi khuẩn gram dương nhưng có hình cầu.

Lactobacillus bulgaricus Streptococus thermophilus

Hình 2.2: Hình ảnh vi khuẩn dưới kính hiển vi

Trong sữa chua người ta thường kết hợp 2 chủng để lợi dụng mối quan hệ cộng sinh giữa 2 chủng này. S.thermophilus không có enzyme protease liên kết với thành tế bào, trong môi trường dịch lên men S.thermophilus được kích thích tăng

trưởng nhờ sự sinh ra các peptide và axit amin, đặc biệt là histidine và glycine, đó là kết quả cả hoạt tính thủy phân protein của L.bulgaricus. Còn L.bulgaricus được

kích thích tăng trường do sự hình thành axit lactic làm hạ pH môi trường, đó là kết quả chuyển hóa đường lactose của S.thermophilus.

Trong sữa chua Vinamilk, người ta nghiên cứu tỷ lệ bổ sung của L/S là 2:1 do hoạt lực và khả năng lên men của Lactobacillus bulgaricus mạnh hơn Streptococus

thermophilus. Trong đề tài tôi cũng áp dụng tỷ lệ L/S là 2:1 như ở sữa chua.

Hai loài vi khuẩn này được tiến hành phân lập từ sữa chua Vinamilk.

i. Bao bì

 Không gây độc hại cho thực phẩm, không làm cho thực phẩm biến đổi chất lượng, không gây mùi vị, màu sắc lạ cho sản phẩm.

 Bền đối với sự tác động của các thành phần trong thực phẩm.  Chịu được nhiệt độ và áp suất cao.

 Truyền nhiệt tốt, chắc, nhẹ.  Dễ gia công, rẻ tiền.

 Hình thức hấp dẫn thích hợp với sản phẩm.  Sử dụng, vận chuyển, bảo quản tiện lợi.

 Nắp chai bằng sắt, được mạ kẽm và sơn lớp vecni chống gỉ.

Với sản phẩm gạo lức lên men lactic, em chọn bao bì thủy tinh do thủy tinh trơ với tác động của thực phẩm, có độ trong suốt cao, hình thức đẹp, khách hàng có thể nhận thấy màu sắc, hình thái của sản phẩm, dễ dàng tái sử dụng.

Tuy nhiên, có thể nghiên cứu thêm một số loại bao bì khác để tạo tính đa dạng bao bì sản phẩm trên thị trường như hủ nhựa, bao bì tetrapad,…

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị dùng cho thí nghiệm a. Hóa chất a. Hóa chất  Môi trường MRS  NaOH 0,1N  Phenolphtalein  Oxy già b. Dụng cụ, thiết bị sử dụng

 Các dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm  Cân phân tích  Tủ nung vuông  Bếp điện  Tủ sấy tiệt trùng  Nồi hấp tiệt trùng  Phòng cấy vô trùng

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Bước đầu thăm dò khả năng lên men của chủng vi khuẩn lactic trên môi trường dịch gạo lức

Để xem vi khuẩn 2 chủng lactic từ sữa chua có phát triển được trên môi trường gạo lức hay không thì phải làm thí nghiệm thăm dò. Nếu có khả quan thì có thể đưa vào nghiên cứu sản xuất. Vi khuẩn được sử dụng cho thí nghiệm thăm dò này là chủng vi khuẩn lactic không thuần khiết được lấy từ sữa chua Vinamilk. Cách tiến hành thăm dò như sau: Gạo lức → Rửa, làm ráo → Rang sơ bộ → Xay bột → Nấu chiết dịch → Lọc thu dịch → Phối chế → Gia nhiệt → Làm nguội nhanh → Cấy vi khuẩn không thuần khiết từ sữa chua Vinamilk → Lên men chính → Lên men phụ → Đánh giá cảm quan, đo pH, rút ra kết luận về khả năng lên men của vi khuẩn lactic này trên môi trường gạo lức.

Kết quả thăm dò thu được như sau: Vi khuẩn có khả năng lên men trên môi trường gạo lức nhưng yếu hơn nhiều so với trên môi trường sữa. pH trung bình của dịch sau lên men là 4,3, protein trong gạo lức cũng có phần đông tụ nhưng rất ít. Như vậy, trong thí nghiệm này có thể dùng 2 chủng vi khuẩn phân lập từ sữa chua Vinamilk. Tuy nhiên nếu có điều kiện thì cần phải nghiên cứu để tìm ra chủng vi khuẩn có khả năng lên men tốt nhất trên môi trường gạo lức.

2.2.2. Phân lập, nuôi cấy và nhân giống vi khuẩn lactic

Từ nguyên liệu sữa chua của công ty Vinamilk mới qua bảo quản trong vòng 4 ngày trở lại, đem phân lập để thu hai chủng vi khuẩn lactic dùng cho thí nghiệm.

Môi trường MRS lỏng gồm các thành phần như bảng 2.1.

Môi trường MRS sau khi pha xong được điều chỉnh pH khoảng 6,2 - 6,5. Đối với MRS có bổ sung agar thì thành phần agar được bổ sung với tỷ lệ 1 – 2%.