2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng được thu nhận, yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu trước khi sử dụng được loại bỏ tạp chất, để ráo nước, vận chuyển về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -20 oC cho đến khi sử dụng.
2.2.2. Phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích (Phương pháp phân tích chi tiết đính kèm phụ lục):
- Xác định hàm lượng khoáng, độ ẩm theo phương pháp chuẩn của AOAC [36 ]. - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldahl [26].
- Định lượng acid lactic bằng phương pháp xác định hàm lượng acid toàn phần theo phương pháp Therner [53].
- Xác định hàm lượng carotenoid (chủ yếu astaxanthin) bằng phương pháp quang phổ [81], [1]. [1 ]
- Xác định hàm lượng lipide tổng số theo phương pháp Folch [26 ].
- Kiểm tra khả năng sinh indol và sinh H2S [44 ] , khả năng khử nitrat thành nitrit của vi khuẩn [46 ].
- Xác định số lượng vi sinh vật theo 10TCN 863:2006: Tiêu chuẩn vi sinh ”Thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm”.
- Xác định màu sắc của cá Tứ Vân theo phương pháp so màu.
- Xác định tốc độ tăng trưởng về chiều dài và tốc độ tăng trưởng về khối lượng của cá Tứ Vân [18 ].
Sinh trưởng tuyệt đối về chiều dài (GRL): GRL = Lt – Lo trong đó Lt:Chiều dài của cá tại thời điểm t (mm), Lo: chiều dài của cá tại thời điểm đầu (mm). Sinh trưởng tuyệt đối về khối lượng (GRw): GRw = Wt – Wo trong đó Wt: Khối lượng của cá tại thời điểm t (gram), Wo: Khối lượng tại thời điểm ban đầu (gram).
- Hiệu suất thu hồi protein, astaxanthin được xác định theo công thức theo công thức của Dauphin [52] như sau:
- Hàm lượng khoáng có trong dịch lên men tính theo công thức sau:
Đánh giá cảm quan: Màu sắc, mùi, trạng thái, ... trong quá trình thí nghiệm và
mẫu thu được sau lên men.
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD (độ lệch chuẩn) để báo cáo. Sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê thí nghiệm (p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích bởi test ANOVA bằng phần mềm SPSS 16 và phần mềm Microsoft Excel 2007.
Nghiên cứu tuyển chọn chủng lactic từ thực phẩm lên men tự nhiên (kim chi, dưa chua…) thích hợp cho việc lên men trong môi trường đầu tôm xay từ đó tạo ra dịch lên men chứa hàm lượng protein và sắc tố cao nhất.
Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp (tỷ lệ chế phẩm, thời gian lên men, hàm lượng rỉ đường) cho quá trình lên men trong môi trường đầu tôm xay.
Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp (tỷ lệ dịch lên men/ thức ăn và tỷ lệ dầu/thức ăn) cho quá trình bổ sung dịch lên men, dầu đậu nành vào thức ăn tổng hợp để nuôi cá Tứ Vân.
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát được thể hiện ở Hình 2.1 sau:
Thuyết minh sơ đồ: Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men chua tự
nhiên (kim chi, dưa cải chua, cà muối chua,...). Sử dụng chủng vi khuẩn sau khi phân lập tăng sinh, bổ sung vào trong môi trường đầu tôm thẻ chân trắng đã xay để lên men. Nghiên cứu thời gian lên men, tỷ lệ chế phẩm bổ sung và hàm lượng rỉ đường nhằm mục đích thu được chất lượng từ dịch lên men là tốt nhất. Sau đó sử dụng dịch lên men thu được bổ sung vào thức ăn tổng hợp để nuôi cá Tứ Vân. Nghiên cứu tỷ lệ dịch lên men để cung cấp chất dinh dưỡng và tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung vào làm màng bao cho thức ăn trước khi nuôi cá.
Thực phẩm lên men lactic tự nhiên
Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
Đầu tôm thẻ chân trắng
Dịch lên men lactic
Phối trộn với thức ăn tổng hợp
Đầu tôm xay
Sản phẩm thức ăn dùng trong nuôi cá Tứ Vân thích hợp Lên men
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hàm lượng rỉ đường? Tỷ lệ chế phẩm/nguyên liệu?
Thời gian?
Tỷ lệ dịch lên men/ thức ăn tổng hợp? Tỷ lệ dầu đậu nành/thức ăn tổng hợp?
Ép Bã
Đánh giá khả năng lên men của các chủng vi khuẩn đã chọn
2.2.4. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện ở Hình 2.2.
Thuyết minh sơ đồ: Từ thực phẩm lên men tự nhiên, tiến hành phân lập trên môi
trường MRS thạch một số chủng vi khuẩn. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được bằng cách kiểm tra hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram, catalase, acid lactic, test sinh hóa gồm khả năng sinh indol, sinh H2S và khử nitrate thành nitrit. Từ những chủng vi khuẩn lactic được chọn sẽ cho vào các mẻ đầu tôm
Thực phẩm lên men chua tự nhiên
Phân lập trên môi trường MRS
Test hình thái Test sinh hóa
Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic
Đánh giá khả năng lên men trong nguyên liệu đầu tôm
Giải trình tự gen
Hình 2.3: Sơ đồ phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
để len men, sau đó đánh giá hàm lượng astaxanthin và protein thu được trong dịch. Từ đó chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid mạnh và phát triển mạnh trong môi trường đầu tôm thẻ chân trắng đã xay. Sau đó nghiên cứu tỷ lệ chế phẩm sử dụng trong lên men đầu tôm, tỷ lệ chế phẩm nghiên cứu là từ 2% (thể tích / khối lượng nguyên liệu) đến 10% (thể tích / khối lượng nguyên liệu) với bước nhảy là 2. Tiếp tục nghiên cứu thời gian lên men cho đầu tôm, thời gian nghiên cứu là 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Tiếp theo nghiên cứu hàm lượng rỉ đường bổ sung vào đầu tôm với tỷ lệ từ 5% (khối lượng / khối lượng) đến 25 % (khối lượng / khối lượng) với bước nhảy là 5. Tỷ lệ chế phẩm, tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men trong nghiên cứu này được dựa vào nghiên cứu của tác giả Bhaskar và cộng sự [42]. Các sản phẩm dịch lên men thu được sẽ xác định hàm lượng astaxanthin, protein và một số thành phần khác, tuy nhiên để lựa chọn được điều kiện lên men thích hợp sẽ dựa vào hai chỉ tiêu là hàm lượng protein và astaxanthin có trong dịch lên men. Sử dụng dịch lên men thu được bổ sung vào thức ăn tổng hợp để nuôi cá Tứ Vân, nghiên cứu xác định tỷ lệ dịch lên men bổ sung vào thức ăn và tỷ lệ dầu bổ sung nhằm mục đích tạo màng bao.
2.2.5. Bố trí thí nghiệm chi tiết
Thuyết minh sơ đồ: Sử dụng thực phẩm lên men tự nhiên như nem chua, dưa cải
muối chua,... phân lập trên môi trường thạch MRS, tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường thạch và quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn lactic thuộc nhóm Gram+. Khi kiểm tra hoạt tính catalase, vi khuẩn lactic thuộc nhóm catalase âm tính. Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hô hấp hiếu khí tùy tiện nên sau khi cấy các chủng phân lập được vào ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng thì đổ một lớp parafin lên phía trên, mục đích là để ngăn cách môi trường thạch với môi trường không khí xung quanh và sau thời gian nuôi 24 giờ tiến hành đo các mẫu ở bước sóng 600 nm để xác định giá trị OD, từ đó xác định được chủng vi khuẩn có thể hô hấp trong môi trường không có oxy. Chọn ra các chủng vi khuẩn thuộc nhóm catalase âm tính, Gram+ và hô hấp hiếu khí tùy tiện để cấy vào trong môi trường ống nghiệm chứa MRS lỏng, sau 24 giờ kiểm tra lượng acid lactic sinh ra trong thời gian nuôi và từ đó chọn ra chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid mạnh. Xác định lượng acid lactic sinh ra thông qua việc xác định acid tổng số. Bên cạnh đó, kiểm tra tính sinh hóa của chủng vi khuẩn bao gồm kiểm tra khả năng tạo indol, tạo H2S và khử nitrate thành nitrit trong điều kiện yếm khí.
Đánh giá khả năng lên men của những chủng vi khuẩn đã lựa chọn thông qua việc kiểm tra chất lượng dịch men đầu tôm: Sử dụng các chủng đã phân lập tiến hành tăng sinh khối trong ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng, thời gian 24 giờ tại nhiệt độ phòng. Sau thời gian tăng sinh khối đưa môi trường chứa các vi khuẩn về cùng một mật độ vi khuẩn là 106 CFU/ml, sau đó bổ sung vào các mẻ đầu tôm khác nhau, điều chỉnh môi trường đầu tôm về pH thích hợp trước khi đưa vi khuẩn vào, thêm thành phần rỉ đường và muối NaCl làm nguồn thức ăn cho vi khuẩn, bên cạnh đó bổ sung kali sorbat và natri benzoat nhằm mục đích phòng thối cho các mẫu. Lên men trong thời gian 24 giờ, nhiệt độ thường. Sau khi lên men tiến hành kiểm tra hàm lượng astaxanthin, hàm lượng protein trong dịch và từ đó chọn ra chủng vi khuẩn thích hợp nhất để sử dụng vào việc lên men đầu tôm thẻ chân trắng.
Chủng vi khuẩn tuyển chọn được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Quá trình định danh được thực hiện bởi phòng xét nghiệm NK-BIOTEK - TP. HCM.
Đầu tôm xay
Phối trộn Natri benzoat 0,1%Kali sorbat 0,1% Muối 1% (w/w)
Rỉ đường 15% (w/w) Tỷ lệ nước 1:1 (v/w)
Lên men với các tỷ lệ chế phẩm vi sinh (% v/w): 2, 4, 6, 8, 10, 12
Thời gian 72 giờ, nhiệt độ phòng
Dịch lên men
Bã Ép
Xác định hàm lượng protein, astaxanthin Chọn tỷ lệ chế phẩm vi sinh thích hợp
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ chế phẩm thích hợp bổ sung vào phế liệu tôm