Thuyết minh sơ đồ: Sử dụng 100 gam đầu tơm xay đạt kích thước khoảng 2 – 3
mm cho một mẫu thí nghiệm, bổ sung nước trong q trình xay với tỷ lệ 1:1 so với khối lượng đầu tôm. Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm lên men có bổ sung lượng chế phẩm vi sinh đã được chọn ở thí nghiệm trên và tiến hành lên men lần lượt ở các tỷ lệ rỉ
Cá Tứ Vân 25 ngày tuổi
Thử nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men lactic (v/w)
0% 5% 10% 15% 20% 25%
Định kỳ 15 ngày xác định: Tốc độ tăng trưởng, màu sắc cá. Xử lý số liệu
Xác định tỷ lệ dịch lên men thích hợp bổ sung vào thức ăn tổng hợp cho cá Tứ Vân
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thử nghiệm tỷ lệ dịch lên men lactic bổ sung
vào thức ăn tổng hợp cho cá Tứ Vân
đường (% w/w) khác nhau là: 5, 10, 15, 20, 25. Trong quá trình lên men thì bổ sung muối 1% (w/w), bổ sung chất phòng thối và theo dõi giá trị pH, thời gian lên men đã chọn ở thí nghiệm trên và ban đầu các mẻ lên men có sử dụng HCOOH để hạ pH xuống 4. Khi lên men diễn ra xong thì lọc qua vải mềm, ép thật chặt để thu được dịch lên men, bã được sử dụng trong sản xuất chitin – chitosan. Xác định hàm lượng protein, astaxanthin, khống có trong dịch lên men. Tiến hành thí nghiệm 3 lần để có kết quả khách quan và chính xác. Chọn tỷ lệ rỉ đường có khả năng mang lại hàm lượng astaxanthin và protein cao nhất trong dịch lên men. Tỷ lệ rỉ đường trong nghiên cứu dựa vào nghiên cứu của tác giả Bhaskar và cộng sự [42].
2.2.5.5. Xác định tỷ lệ dịch lên men đầu tôm bổ sung vào thức ăn tổng hợp cho cá Tứ Vân
Thuyết minh sơ đồ: Sản xuất dịch lên men từ nguyên liệu đầu tôm thẻ chân
trắng theo các thông số đã nghiên cứu ở trên. Bổ sung dịch lên men vào thức ăn tổng hợp cho cá theo các tỷ lệ 0% (mẫu đối chứng), 5%, 10%, 15%, 20%, 25% (v/w). Bổ sung 10% dầu đậu nành để tạo màng bao. Cá Tứ Vân được bố trí trong 6 nghiệm thức trên. Các nghiệm thức thực hiện trong bể thủy tinh có thể tích 160 lít được chia thành
Cá Tứ Vân 25 ngày tuổi
Thử nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đậu nành (v/w)
0% 5% 10% 15% 20% 25%
Định kỳ 15 ngày xác định: Tốc độ tăng trưởng, màu sắc cá. Xử lý số liệu
Xác định tỷ lệ dầu thích hợp bổ sung vào thức ăn cho cá Tứ Vân
Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thử nghiệm tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung vào thức ăn tổng cho cá Tứ Vân 20 ngăn, nuôi cá trong 18 ngăn. Mỗi ngăn nuôi 3 cá Tứ Vân và mỗi nghiệm thức nuôi 3 ngăn. Thời gian tiến hành thí nghiệm là 45 ngày. Sau đó đánh giá tốc độ sinh trưởng và màu sắc của cá Tứ Vân sau một thời gian nuôi để đưa ra tỷ lệ dịch lên men bổ sung vào thích hợp.
2.2.5.6. Xác định tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung vào làm màng bao cho thức ăn tổng hợp khi đã bổ sung dịch lên men lactic từ nguyên liệu đầu tôm
Thuyết minh sơ đồ: Bổ sung tỷ lệ dịch lên men đã được chọn ở thí nghiệm
2.3.5.5 vào thức ăn sau đó bố trí các mẫu thí nghiệm xác định tỷ lệ dầu đậu nành bổ sung lần lượt như sau: 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% (v/w). Cá Tứ Vân được bố trí trong 6 nghiệm thức trên. Các nghiệm thức được thực hiện trong bể thủy tinh có thể tích 160 lít được chia thành 20 ngăn, nuôi cá trong 18 ngăn, tại mỗi ngăn nuôi 3 cá Tứ Vân và mỗi nghiệm thức nuôi 3 ngăn. Thời gian tiến hành thí nghiệm 45 ngày.
Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men chua
Phân lập vi khuẩn từ một số loại thực phẩm lên men chua (kim chi, nem chua, dưa cải muối chua, cà muối chua) trên môi trường chọn lọc MRS, kết quả phân lập được 16 chủng vi khuẩn. Hình thái khuẩn lạc, tế bào được mơ tả ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Một số đặc điểm hình thái của 16 chủng vi khuẩn phân lập được
Thời gian
phân lập Nguồn gốc
Kí hiệu
chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào 28/11/201
2 Kim chi LB1
Vàng đục, tâm xậm màu,
trịn, khơng đều Trực khuẩn nhỏ 28/11/201
2 Nem chua LB2 Nhỏ, tròn, trắng đục Trực khuẩn, kết chùm 28/11/201
2 Nem chua LB3 Trắng trong, tròn, to Trực khuẩn ngắn 28/11/201
2 Cà muối chua LB4 Tròn, trắng sữa, trong Trực khuẩn, kết chùm 10/12/201
2 Kim chi LB5 Nhỏ, tròn, trắng sữa Trực khuẩn ngắn, đơn 10/12/201
2 Nem chua LB6 Trắng đục, trịn lồi
Hình cầu kết dạng chùm
10/12/201
2 Kim chi LB7 Nhỏ, trịn, bóng,màu trắng sữa Trực khuẩn ngắn, nhỏ,kết đôi 10/12/201
2 Cà muối chua LB8 Trịn, bề mặt khơ, nhăn Trực khuẩn kết chuỗi 18/12/201
2 Kim chi LB9 Trịn, trơn bóng, trắng Cầu kết đôi 18/12/201
2
Dưa cải muối
chua LB10 Nhỏ, trịn, trắng sữa, bóng Trực khuẩn mập, kết chuỗi, kết chùm 18/12/201
2 Dưa cải muối LB11 Trắng, bề mặt khô Cầu kết dạng chùm 18/12/201
2 Cà muối chua LB12 Trắng đục, bề mặt trơn lồi Trực khuân ngắn 26/12/201
2 Kim chi LB13 Tròn, trằng đục
Trực khuẩn, đơn, kết chùm
26/12/201
2 Dưa cải muốichua LB14 Trịn, trắng đục, bóng Trực khuẩn hơi dài 26/12/201
26/12/201 2
Dưa cải muối
chua LB16
Trịn, trắng đục, bề mặt
nhăn Cầu kết chùm
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB2
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB4
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc và tế bào
của chủng vi khuẩn LB7
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, trong 16 chủng vi khuẩn đã phân lập có 5 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn kim chi chiếm 31%, 3 chủng từ nem chua chiếm 19%, 4 chủng từ dưa chua chiếm 25% và 4 chủng từ cà muối chua chiếm 25%. Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực phân lập vi khuẩn từ các nguồn khác nhau như nghiên cứu của Đào Thị Lương và cộng sự phân lập vi khuẩn lactic từ 30 nguồn cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước bún, kết quả đã phân lập được 134 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS, thời gian 48 h ở 30 oC [22] hay nghiên cứu của Hồ Diễm Thúy phân lập được 27
chủng vi khuẩn lactic từ các mẫu bã sắn ủ với các nguồn lên men lactic (nem chua, kim chi, tôm chua) và từ bã sắn ủ với kim chi đã phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất, chiếm 37% [29]. Vậy từ các nguồn khác nhau ta có thể phân lập được nhiều chủng vi khuẩn và từ đó chọn lọc ra chủng vi khuẩn lactic cần thiết để ứng dụng cho các cơng trình nghiên cứu tiếp theo.
Theo Akhter chủng vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương [35] nên để chọn được chủng vi khuẩn lactic thì bước đầu 16 chủng vi khuẩn phân lập được nhuộm Gram. Kết quả nhuộm và hình ảnh Gram của một số chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2: Một số đặc tính sinh hóa của 16 chủng vi khuẩn
Chủng vi
khuẩn Hoạt tínhcatalase NhuộmGram Chủng vikhuẩn Hoạt tínhcatalase Nhuộm Gram
LB1 + - LB9 - - LB2 - + LB10 + + LB3 - - LB11 - - LB4 - + LB12 - - LB5 - + LB13 + + LB6 + - LB14 - - LB7 - + LB15 - - LB8 - - LB16 - -
Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy, trong 16 chủng phân lập từ nguyên liệu lên men có 6 chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và 10 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm. Những vi khuẩn Gram dương bắt màu tím sau khi được nhuộm Gram có thể giải thích là do cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram âm, nhưng thành phần lipid lại thấp hơn. Trong giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi khuẩn Gram âm bị cồn hòa tan nên chất nhuộm ban đầu hịa tan vào dung mơi. Ngược lại, vi khuẩn Gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet – iodine không bị phai ra dung mơi xung quanh do đó vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu [4].
Bên cạnh đó, trong 6 chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương thì vi khuẩn được phân lập từ nguồn kim chi chiếm 50% số lượng vi khuẩn được chọn vậy đây là nguồn thực phẩm lên men chua chiếm ưu thế trong quá trình phân lập.
a b Hình 3.4: Hình nhuộm Gram của một số chủng vi khuẩn
(a): chủng LB2; (b): chủng LB4
Ngoài ra, việc xác định các chủng vi khuẩn đã chọn có khả năng phát triển trong điều kiện kị khí và tạo ra acid là quan trọng vì vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn hơ hấp yếm khí tùy ý và dựa vào lượng acid tổng số do vi khuẩn sinh ra trong mơi trường MRS lỏng ta có thể đánh giá được khả năng lên men của những chủng vi khuẩn ở công đoạn sau này, việc tạo ra acid nhiều giúp cho công đoạn lên men đầu tơm diễn ra thuận lợi hơn vì làm giảm pH nên có thể khống chế q trình thối do trực khuẩn butyric yếm khí gây ra [19]. Do đó, 6 chủng được ni trong mơi trường MRS lỏng yếm khí, chọn những chủng có thể phát triển tạo sinh khối trong mơi trường khơng có khí oxy. Đánh giá khả năng phát triển của 6 chủng ta tiến hành đo OD600 sau thời gian nuôi 24 giờ, tại nhiệt độ 37 oC, đồng thời đo lượng acid tổng số sinh ra theo phương pháp Therner. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Giá trị OD600 của một số chủng vi khuẩn
Chủng LB2 LB4 LB5 LB7 LB10 LB13
OD600 0,919 0,873 1,016 1,024 0,927 1,105
Acid tổng số (g/l) 5,4 19,8 16,2 22,1 6,7 14,7
Từ Bảng 3.3 cho thấy, trong cùng một điều kiện mơi trường yếm khí cả 6 chủng vi khuẩn đều có khả năng phát triển tạo sinh khối, trong đó chủng LB13 có giá trị OD cao nhất so với 5 chủng vi khuẩn còn lại. Tuy nhiên, kết quả đo hàm lượng acid tổng số trong Bảng 3.3 cho thấy, khả năng tạo ra acid tổng số cao nhất là chủng LB7, lượng acid tổng số của chủng này cao gấp 4 lần so với chủng LB2 và cao hơn chủng LB13. Trong nghiên cứu của Bùi Thị Thu Huyền và cộng sự thì khả năng sinh acid trên mơi trường MRS lỏng của 8 vi khuẩn phân lập từ các mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua đạt cao nhất là 23,4 g/l [16]. Kết quả trên so với kết quả được ghi nhận ở nghiên cứu của Bùi Thị Thu Huyền thì lượng acid tổng số thu được thấp hơn nhưng khơng đáng kể.
Các chủng trên có khả năng tạo ra acid trong mơi trường ni cấy MRS lỏng yếm khí, ở 37 oC nên có thể nghi ngờ 6 chủng vi khuẩn được chọn thuộc chủng vi khuẩn lactic vì vậy sử dụng 6 chủng đã chọn thực hiện kiểm tra một số test sinh hóa bao gồm: tạo sản phẩm indol trong môi trường SIM, sinh H2S trong môi trường SIM, khử nitrat thành nitrit trong canh trường chứa nitrat [67] sau đó lên men thử nghiệm đầu tôm thẻ chân trắng để chọn ra chủng vi khuẩn có thể phát triển phù hợp trong mơi trường đầu tơm trước khi giải trình tự gen 16rRNA.
3.1.2. Kết quả test sinh hóa của những chủng vi khuẩn được chọn
6 chủng vi khuẩn sau khi được lựa chọn ở trên sẽ được test sinh hóa để chọn ra chủng vi khuẩn có những đặc tính sinh hóa giống với chủng vi khuẩn lactic nhằm giúp q trình lên men đầu tơm tiếp theo diễn ra tốt hơn.
Những chủng vi khuẩn được chọn nuôi cấy trong môi trường SIM đã thanh trùng, thời gian nuôi vi khuẩn 24 giờ ở 37 oC. Nếu vi khuẩn có enzyme tryptophanase trong tế bào thì nó chuyển hóa mơi trường trypton thành các dạng indol, nhận biết được nhờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs sẽ cho kết quả dương tính (màu đỏ cánh sen) hoặc âm tính (màu vàng nhạt).
Tryptophanase Acid
L – tryptophan + H2O Indol + acid Pyruvic + NH3
Thuốc thử Kovacs + Idol dương tính (màu đỏ cánh sen) Nếu vi khuẩn khơng có enzyme tryptophanase thì khơng tạo thành các dạng indol nên kết quả sẽ có màu vàng nhạt. Kết quả thí nghiệm thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5: Hình kiểm tra khả năng chuyển hóa tạo indol của 6 chủng vi khuẩn
Kết quả ở Hình 3.5 cho thấy, những chủng vi khuẩn khi kiểm tra khả năng chuyển hóa tryptophan tạo thành indol điều có kết quả âm tính vì cho màu vàng nhạt sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs, vậy trong tế bào của 6 chủng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm trên khơng có enzyme tryptophanase. Trong nghiên cứu của tác giả Ngô Thị Phương Dung và cộng sự khi kiểm tra khả năng chuyển hóa tryptophan ở 6 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thức ăn lên men chua cho kết quả âm tính [6]. Vậy đặc tính khơng có khả năng chuyển hóa tạo indol của 6 chủng vi khuẩn đã chọn giống với đặc tính của vi khuẩn lactic. Do vậy nghi ngờ 6 chủng vi khuẩn này thuộc nhóm vi khuẩn lactic.
Sau khi kiểm tra khả năng tạo các dạng indol của 6 chủng vi khuẩn thì tiếp tục đánh giá khả năng sinh H2S của các chủng vi khuẩn. Những chủng vi khuẩn cũng được nuôi trong môi trường SIM đã tiệt trùng, đọc kết quả sau 24 giờ nuôi tại 37 oC. Sau khi nuôi, nếu mơi trường có màu đen là kết quả dương tính và khơng tạo màu là kết quả âm tính. Kết quả thể hiện ở Hình 3.6.
Kết quả thu được ở Hình 3.6 cho thấy, 6 chủng vi khuẩn có kết quả âm tính. Trong nghiên cứu của tác giả Vasilica [38] người ta tiến hành kiểm tra khả năng sinh H2S chủng vi khuẩn lactic, kết quả thu được là những chủng vi khuẩn lactic khơng có khả năng sinh H2S. Như vậy 6 chủng vi khuẩn đã chọn cho kết quả tương tự với kết quả khi nghiên cứu dặc tính sinh hóa trên đối tượng vi khuẩn lactic.
Tiếp tục 6 chủng vi khuẩn này được tiến hành kiểm tra khả năng khử nitrat thành nitrit trong canh trường chứa nitrat. Nguyên tắc của kiểm tra sinh hóa này là xác định khả năng khử nitrat thành nitrit hoặc sinh hơi nitrogen tự do ở vi sinh vật. Thời gian nuôi 24 giờ tại 37 oC, trong điều kiện yếm khí, sau khi nhỏ thuốc thử chứa alpha – napthylamine và sulfanilic acid, kết quả dương tính khi cho màu đỏ, cịn những mẫu khơng thay đổi màu thì bổ sung thêm bột kẽm, nếu mẫu chuyển sang màu từ đỏ thì cho kết quả âm tính, nếu khơng thay đổi màu là kết quả dương tính. Kết quả thu được sau khi tiến hành thí nghiệm trên 6 chủng vi khuẩn đã chọn thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7: Hình kiểm tra khả năng khử nitrat của 6 chủng vi khuẩn
Kết quả ban đầu khi bổ sung thuốc thử chứa alpha – napthylamine và sulfanilic acid vào 6 mẫu thí nghiệm thì chỉ có chủng LB13 là chuyển sang màu đỏ, vậy kết luận chủng LB13 dương tính hay có khả năng khử nitrat. Cịn lại 5 chủng khơng có thay đổi màu, tiếp tục bổ sung một lượng bột kẽm và lúc này chủng LB2 và LB7 chuyển sang màu đỏ nên kết quả âm tính, chủng LB4, LB5, LB10 khơng thay đổi màu nên cho kết quả dương tính. Kết quả được ghi nhận theo những nghiên cứu của tác giả Aarti và cộng
sự thì vi khuẩn lactic phân lập từ sản phẩm Dahi khơng có khả năng khử nitrat do đó chọn