Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được ly trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt, 1992.
Ly trích và phân đoạn
Lấy ngẫu nhiên 5 gam phát hoa Đa Lộc ở ba giai đoạn: cuối giai đoạn “nụ phát hoa”, “mở phát hoa sớm”, “mở phát hoa muộn” đem nghiền nhỏ, thêm 20 ml methanol 80 %, để trong tối, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và thu lấy dịch lọc I.
Hoàng Quốc Khánh
Thêm vào bã 20 ml methanol 80 %, lắc khoảng 20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như
trên thêm một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chung ba dịch lọc I, II. III, cô cạn dịch lọc này còn khoảng 1 ml.
Thêm nước cất vào cho đủ 5 ml, dịch nước được chỉnh pH = 2,5 bằng dung dịch HCl 1 %. Cho dịch nước này vào bình lóng, thêm 15 ml ether, lắc bình lóng khoảng 20
phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp. Tách lấy dịch nước (lớp dưới) vào một becher và dịch ether (lớp trên) vào một becher khác. Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa.
Từ dịch nước thu được, chỉnh pH = 7 và tiến hành lóng tương tự như trên (ba
lần). Tất cả dịch ether thu được của những lần lóng được cho vào bình lóng, thêm 3 ml dung dịch NaHCO3 8 %, lắc khoảng 5 phút. Để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lại như vậy một lần nữa với 3 ml NaHCO3 8 %. Dịch ether (lớp trên) thu được, cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5
ml để chuẩn bị cho sự sắc ký (hình 2.1).
Sắc ký
Dùng viết chì vạch một đường thẳng cách mép dưới bản mỏng silicagel F254 (20 cm x 20 cm) khoảng 2 cm. Dùng micropipet chấm dịch ether đã quạt cạn (thu từ
phần ly trích) chấm lên đường kẻ thành một điểm.
Chú ý, sau mỗi lần chấm, dùng máy sấy lạnh làm khô vị trí này rồi mới tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch ether. Nên chấm các chấm thật nhỏ (≤ 5 mm). Chấm một
điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn gồm Zeatin, AIA, AAB và GA3 tinh khiết có nồng độ 250 mg/l cho mỗi chất.
Đặt bản mỏng sắc ký vào thùng sắc ký và sử dụng dung môi di chuyển có tỉ lệ
chloroform : methanol : acid acetic = 80 : 15 : 5 (theo thể tích). Do mao dẫn, dung môi sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc ký và tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bảng sắc ký. Khi mức dung môi
Hoàng Quốc Khánh
di chuyển gần hết bản sắc kí, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc kí này (chú ý giữ theo đúng chiều di chuyển của dung môi).
Sinh trắc nghiệm
Hoạt tính auxin và acid abcisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa.). Hạt lúa được gieo trên bông ẩm trong tối ở nhiệt độ 30 0C ± 2 0C.
Sau năm ngày, tách lấy diệp tiêu trong phòng tối. Khúc cắt diệp tiêu lúa trong các sinh trắc nghiệm được để trong tối, nhiệt độ 30 0C ± 2 0C và đo chiều dài sai biệt trong 24 giờ. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với sai biệt về chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung
dịch chuẩn AIA tinh khiết 1 mg/l. Hoạt tính acid abcisic tỷ lệ nghịch với sai biệt về
chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn AAB tinh khiết 1 mg/l.
Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách
(Lactuca sativa L.). Gieo hạt xà lách trên bông ẩm, ở nhiệt độ 30 0C ± 2 0C. Sau một ngày, chọn các hạt có rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ. Cây mầm xà lách trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ 30 0C ± 2 0C, đo
chiều dài sai biệt sau 72 giờ. Hoạt tính giberelin tỷ lệ thuận với sự sai biệt về chiều dài của trụ hạ diệp cây mầm xà lách so với chuẩn là nước cất và GA3 tinh khiết 10 mg/l.
Hoạt tính cytokinin được đo trên sự tăng trưởng trọng lượng của tử diệp dưa
chuột (Cucumis sativus L.). Hạt dưa chuột được gieo trên bông ẩm, nhiệt độ 30 0C ± 2
0
C. Khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hạt, thu lấy tử diệp. Tử diệp dưa chuột trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ 30 0C ± 2 0C,
đo trọng lượng sai biệt sau 48 giờ. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với sự sai biệt về trọng lượng của tử diệp dưa chuột so với chuẩn là nước cất và BA tinh khiết 1 mg/l.
Hoàng Quốc Khánh Hình 2.1. Sơ đồ ly trích và phân đoạn lá bắc Chỉnh pH~ 7, Thêm 10 ml Ether, lắc liên tục 15 phút ( 3 lần) Dịch butanol + 3 ml NaHCO3 8 % (3 lần) Dịch Ether Dịch nước (bỏ) Dịch Ether Sắc ký Quạt cạn~ 1 ml 5 g lá Bắc + 20 ml Methanol 80 % (Ngâm 24 giờ) Cô cạn dịch lọc còn ≈ 1 ml Bình lóng, thêm 15 ml Ether, lắc 20 phút Dịch nước (lớp dưới) Lắc, lọc dung dịch Thêm 5 ml nước cất, chỉnh pH~ 2,5 (HCl 10 %) Dịch Ether (lớp trên) Chú ý: Tất cả các thao tác đều tiến hành trong tối. Dịch nước (bỏ) Dịch Ether Sắc ký Quạt cạn~ 1 ml + 3 ml NaHCO3 8 % (3 lần)
Hoàng Quốc Khánh