1.5.1. Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-32oC. Tuy
Vang thô
Vang thành phẩm
Tiếp tục tàng trữ Đóng chai để tiêu thụ Tách cặn và lọc bằng
máy lọc khung bản
- Tách cặn sau đó lắng bằng albumin 3 - 4 g/l; - Tàng trữ (tàng trữ ở nhiệt độ thấp vài tháng, nhiệt độ không quá 200C).
Dịch quả
Dịch lên men
Vang non
- Điều chỉnh độ Brix bằng saccharose;
- Điều chỉnh pH bằng acid citric hoặc acid lactic;
- Sulfit hóa bằng NaHSO3 30 - 120 mg/l.
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae 2 - 3%; - Lên men ở 28-320C, pH = 3,8 – 4,2.
nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác, nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường xuống còn 20-25oC sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8-10h nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28-30oC, tiếp đó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh
hơn Saccharomyces 2-3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6-8
lần. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyt và tổn thất theo CO2 sẽ tăng.
Đối với quá trình lên men rượu vang có gas, nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men. Một số tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trao đổi chất của nấm men và thành phần các hợp chất hương hình thành trong rượu thành phẩm [4]. Năm 1994, Jackson đã đưa ra luận điểm rằng các hợp chất tạo hương như isoamyl acetate, isobutyl acetate và hexyl acetate… được tổng hợp và được giữ lại trong rượu chỉ khi ở nhiệt độ lên men thấp từ 8÷15.
1.5.2. pH
Nồng độ ion H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh truờng.
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5-5,0. Đối với dịch đường từ tinh bột thì pH cần giữ trong khoảng 4,8 – 5,2 nhằm kết hợp giữ cho amylase tiếp tục chuyển hoá tinh bột và dextrin thành đường lên men được. pH của nước quả thường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và vi khuẩn. Nếu pH thấp khoảng 3,0-4,0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế. pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm không đặc trưng về vị do dễ bị nhiễm
khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp và sản phẩm không đặc trưng về vị.
Nếu pH nhỏ hơn 4,2 thì nấm men phát triển chậm so với ở pH 4,5 – 5,0, tuy nhiên các tạp khuẩn hầu như không phát triển. Tới một lúc nào đó, nếu nấm men đã phát triển và vừa đủ mạnh thì ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn phát triển nhưng vì nấm men đã nhiều và đủ mạnh để lấn áp nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho nấm men.
Ta có thể điều chỉnh bằng acid citric hay dùng NaHCO3 để giảm hoặc tăng pH tuỳ thuộc dịch ép trái cây.
1.5.3. Nồng độ chất hòa tan của dịch lên men
Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men. Mặt khác nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển.
1.5.4. Thời gian
Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,… Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men.
1.5.5. Oxy
Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho nước ép tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích luỹ một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành rượu vi sinh vật phải được phát triển trong điều kiện hiếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức
chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men. Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân huỷ một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hoá thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có cồn nhiều thì không được thoáng khí môi trường. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hoá thành acid acetic làm sản phẩm bị chua
1.5.6. Nồng độ CO2 trong môi trường
CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường; một phần tách lên trên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường. CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi.
Theo Muler Turgar, với nồng độ 0,25% trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ ức chế sự sinh sản của nấm men rượu. Theo Smitener, sự sinh sản của nấm men ngừng lại khi nồng độ CO2 lên đến 1,5% trọng lượng. Lượng CO2 này tương ứng với áp suất 7,7 atm ở 15oC.
Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy, các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào.
1.5.7. Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men
Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng.
1.5.8. Hàm lượng giống nấm men
Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hoá đường thành etanol và khí carbonic. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau. Cùng loài nấm men,
nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì cũng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau. Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được lựa chọn.
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Nghiên cứu khoa học về Cacao, trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu. Từ tháng 9/2013 đến tháng 7/2014.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
- Tủ cấy vô khuẩn có đèn UV;
- Kính hiển vi quang học OLYMPUS: Quan sát tế bào vi sinh vật;
- Nồi khử trùng (HIRAYAMA HV- Nhật Bản): Hấp khử trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm; - Cân phân tích; - Máy đo pH ; - Brix kế; - Buồng đếm hồng cầu; - Bộ chưng cất cồn; - Máy lắc ngang; - Tủ lạnh Sanyo;
- Bình lên men thủy tinh; - Bình lên men nhựng 500 ml; - Bình lên men nhựa 300 ml; - Pipetman, đèn cồn,...
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu a) Vật liệu chính a) Vật liệu chính
- Dịch quả Cacao được cung cấp từ trung tâm chuyển giao công nghệ Cacao Thành Đạt, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu;
- Giống nấm men: S1 và S2 được cung cấp từ viện kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh và viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội.
b) Hóa chất - Đường glucose; - Đường saccharose ; - Pepton ; - KH2PO4; - MgSO4.7H2O; - Agar ; - Xanh methylen; - Cồn 980; - NaHSO3; - Na2CO3.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tuyển chọn giống nấm men
Nấm men được lựa chọn đương nhiên là phải có đặc tính kỹ thuật phù hợp với sản xuất rượu vang. Sự đa dạng của đặc tính không chỉ phụ thuộc vào loại rượu mà còn phụ thuộc vào quan điểm khác nhau của những nhà chuyên môn.
Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóa hoàn toàn và có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vị không mong muốn thì ngày nay, do yêu cầu ngày càng cao, Saccharomyces cerevisiae cần phải có nhiều đặc tính khác, như liệt kê trong mục 1.3.2.
Tuy nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các chỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian. Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương pháp đơn giản và hiệu quả để chọn lựa nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chất công nghệ của nấm men vang. Phương pháp này chỉ bao gồm 2 bước:[11]
Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chịu đựng đối với SO , các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp;
Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.
2.2.2. Phương pháp huấn luyện giống thích nghi – nâng cao chất lượng giống
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng thích nghi rất cao đới với mọi tác động của môi trường. Những tác động vừa đủ của môi trường được lặp đi lặp lại nhiều lần tạo nên thích nghi bền vững. Tính thích nghi của vi sinh vật như là một biện pháp hữu hiệu để vi sinh vật tồn tại, pháp triển trong những điều kiện môi trường khác nhau. Dựa vào nguyên tắc trên ta có thể tạo ra giống tốt với điều kiện sản xuất công nghiệp.
Đối với quá đồ án này, giống thuần sau khi được tăng sinh trong môi trường nước khoai tây sau 24h sẽ được cho qua môi trường bán Cacao trước khi bổ sung vào dịch lên men.
2.2.3. Phương pháp phân tích a) Kiểm tra độ Brix a) Kiểm tra độ Brix
Sử dụng Brix kế. Dùng đũa khuấy khuấy nhẹ dung dịch cần đo nồng độ chất hòa tan, lấy ra một giọt chấm vào mặt kính. Đậy nắp kính lại. Quan sát và đọc độ Brix qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Xoay nhẹ ống kính để nhìn rõ nếu thấy thang đo bị mờ. Sau đó rửa lại kính bằng nước cất và lau khô nhẹ nhàng bằng giấy thấm.
b) Kiểm tra hàm lượng cồn
- Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa khối lượng của dung dịch rượu với nước cất ở cùng thể tích, trong cùng điều kiện, người ta xác định tỷ trọng của dung dịch rượu với nước. Từ giá trị tỷ trọng ta biết được nồng độ rượu trong dung dịch.
- Cách tiến hành:Lấy 50ml dịch trong sau lên men cho vào bình định mức 50ml, rót dịch vào bình cầu rồi tráng bình bằng 50ml nước cất rồi cũng đổ vào bình cầu dung tích 250ml. Nối bình với hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất và thu hồi nước ngưng vào bình định mức 50ml cho đến khi nước ngưng đầy tới ngấn 50ml. Cân bình tỷ trọng sạch và khô ta được trọng lượng bình m0. Sau đó đổ đầy nước cất,
từ từ đậy nắp sao cho không có bọt khí xuất hiện. Lau khô bình, cân được khối lượng bình chứa nước cất mn. Tráng bình bằng 2 lần dịch muốn xác định tỷ trọng. Làm tương tự như với nước cất ta cân được khối lượng bình chứa rượu mr. Đo nhiệt độ của nước và dung dịch.
- Tính kết quả:Tỷ trọng của dung dịch sau lên men:
0 0 20 20 m m m m d n r
Hiệu chỉnh giá trị trước khi tra bảng nếu nhiệt độ khi cân khác 20oC. Bảng tra tham khảo phần phụ lục TCVN 8008 - 2009.
c) Đếm tế bào nấm men dưới kính hiển vi, sử dụng buồng đếm hồng cầu.
- Cách tiến hành:
Dùng Micropipet hút dung dịch nấm men đã pha loãng bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm.
Đặt lame phủ lên khung đếm. Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lame. Nếu có bọt khí xuất hiện thì phải làm lại.
Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm.
Dùng vật kính X10 để điều chỉnh sơ bộ để tìm buồng đếm, sau đó đếm tế bào bằng vật kính X40.
Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ, cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô.
- Công thức tính:
N =
h
a.4000.1000
Với: N: số tế bào có trong 1 ml mẫu
a: số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/4000 mm3) 4000: số qui đổi từ 1/4000 mm3 thành mm3
1000: số qui đổi từ 1 mm3 thành 1 ml (1 ml = 1000 mm3) h: hệ số pha loãng
d) Kiểm tra sự thay đổi pH
Sử dụng máy đo pH điện tử của phòng thí nghiệm vi sinh. (TCVN 2655:1978) Cách tiến hành: Rửa sạch đầu đo, lau khô bằng giấy thấm, nhúng đầu đo vào dung dịch cần đo. Đọc giá trị pH trên màn hình. Khi đo nhiều lần liên tiếp thì sau mỗi lần đo, làm sạch bằng cách nhúng đầu đo vào nước cất. Sau khi đo xong, rửa sạch đầu đo, lau khô và tắt máy.
2.2.4. Phương pháp đánh giá sản phẩm
Sau khi lên men khoảng 7 -10 ngày, dịch thu được gọi là vang non, vong non đã có được độ cồn gần như mong muốn. Tuy nhiên vẫn chưa hoàn thiện về màu, mùi và vị. Để đánh giá được sản phẩm rượu vang non chủ yếu được kiểm định qua màu và nồng độ cồn. Các yếu tố khác được đánh giá và cảm quan sau giai đoạn lên men phụ.
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Khảo sát quá trình tăng sinh giống nấm men S1
Tăng sinh giống nấm men: Nấm men được tăng sinh 2 cấp. Cấp 1: sử dụng giống gốc tăng sinh bằng môi trường nước khoai tây trong 24 giờ. Cấp 2 (huấn luyện giống): sử dụng giống đã tăng sinh cấp 1 cho vào môi trường bán Cacao. Môi trường khoai tây được chuẩn bị: 200 gam khoai tây được nấu chung với 1 lít nước trong 3h, sau đó chiết lấy nước và bổ sung 30 gam glucozo, định mức bằng nước cất đến 1 lít, hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. Môi trường bán cacao: 0,5 lít môi trường khoai tây + 0,5 lít dịch Cacao, điều chỉnh Brix bằng đường saccharose đến giá trị 12. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ môi trường 29 – 32oC, lắc bằng