Các loài nấm men thuần khiết dùng nhiều trong sản xuất rượu vang thuộc giống
Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces oviformis. Các chủng nấm men thuần
khiết này, có sự khác nhau về tốc độ sinh trưởng, khoảng nhiệt độ thích hợp để lên men, khả năng tạo cồn và chịu cồn, khả năng chịu được pH thấp cũng như khả năng kết lắng (tạo thành dạng bông hoặc dạng bụi).
- Có hoạt lực lên men cao đối với nước quả; - Sử dụng đường cho lên men gần như hoàn toàn; - Kết lắng tốt;
- Làm trong dịch rượu nhanh;
- Chịu được độ rượu cao và độ acid của môi trường cũng như các chất sát trùng; - Tạo cho rượu hương vị thơm ngon tinh khiết.
Cụ thể :
Đặc tính lên men:
- Thích nghi với quá trình lên men nhanh;
- Tốc độ sử dụng cơ chất và tốc độ hình thành sản phẩm cao; - Khả năng chịu cồn cao;
- Khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao; - Sinh khối tạo thành vừa phải;
Các tính chất về hương vị
- Tạo thành ít sulphite/DMS/thiol; - Tạo thành ít acid dễ bay hơi; - Tạo thành ít rượu bậc cao;
- Giải phóng ra các tiền chất hương glycosylate; - Hoạt tính esterase thấp;
Đặc tính công nghệ
- Tính ổn định cao về mặt di truyền; - Khả năng chịu sulphite cao;
- Ít liên kết với sulphite; - Ít tạo bọt;
- Có khả năng kết bông; - Kết lắng cặn nhanh; - Nhu cầu nitơ thấp;
Các đặc tính trao đổi chất có liên quan đến sức khỏe con người - Tạo thành ít sulphite;
- Tạo thành ít biogenic amine;
- Tạo thành ít ethyl carbamate (urea); 1.4. Qui trình chung lên men rượu vang
Qui trình lên men rượu vang bao gồm các cơ bản sau:
Xủ lí và điều chỉnh dịch quả: Khi được ép từ quả, hạt đa phần dịch quả đều bị nhiễm các tạp khuẩn và nấm men dại từ vỏ, môi trường, nếu không hạn chế được điều này quá trình lên men sẽ không đạt chất lượng, thông thường người ta sẽ dùng NaHSO3 để thanh trùng. Dịch quả sau khi được thanh trùng sẽ tiếp tục đều chỉnh các thông số phù hợp cho quá trình lên men. Vì lượng đường trong dịch quả không đáng kể nên muốn có được hàm lượng cồn cao cần phỉ bổ sung đường, trong lên men rượu vang nho và các loại các loại khác người ta thường sử dụng đường saccharose. Độ pH của dịch quả thường không được như mong muốn, đa phần thường thấp hơn, khi đó dùng NaHCO3 điều chỉnh phù hợp, một vài loại dịch có pH cao thì dùng acid citric hoặc acid lactic.
Bổ sung nấm men: nấm men được đưa vào dịch quả với hàm lượng thích hợp Lên men được thực hiện trong các thiết bị lên men chuyên dụng, đảm bảo kín, có hệ thống kiểm soát nhiệt độ.
Lọc: Tách bỏ phầm nấm men và cặn bã lắng ra khỏi dịch vang non
Sơ đồ 1.1. Qui trình lên men rượu vang
Lên men phụ, tồn trữ: Thông thương rượu vang non được tồn trữ 6-12 tháng để đảm bảo rượu vang có hương vị tốt nhất và ổn định trước khi tiêu thụ.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 1.5.1. Nhiệt độ 1.5.1. Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-32oC. Tuy
Vang thô
Vang thành phẩm
Tiếp tục tàng trữ Đóng chai để tiêu thụ Tách cặn và lọc bằng
máy lọc khung bản
- Tách cặn sau đó lắng bằng albumin 3 - 4 g/l; - Tàng trữ (tàng trữ ở nhiệt độ thấp vài tháng, nhiệt độ không quá 200C).
Dịch quả
Dịch lên men
Vang non
- Điều chỉnh độ Brix bằng saccharose;
- Điều chỉnh pH bằng acid citric hoặc acid lactic;
- Sulfit hóa bằng NaHSO3 30 - 120 mg/l.
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae 2 - 3%; - Lên men ở 28-320C, pH = 3,8 – 4,2.
nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác, nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường xuống còn 20-25oC sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8-10h nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28-30oC, tiếp đó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh
hơn Saccharomyces 2-3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6-8
lần. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyt và tổn thất theo CO2 sẽ tăng.
Đối với quá trình lên men rượu vang có gas, nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men. Một số tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trao đổi chất của nấm men và thành phần các hợp chất hương hình thành trong rượu thành phẩm [4]. Năm 1994, Jackson đã đưa ra luận điểm rằng các hợp chất tạo hương như isoamyl acetate, isobutyl acetate và hexyl acetate… được tổng hợp và được giữ lại trong rượu chỉ khi ở nhiệt độ lên men thấp từ 8÷15.
1.5.2. pH
Nồng độ ion H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh truờng.
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5-5,0. Đối với dịch đường từ tinh bột thì pH cần giữ trong khoảng 4,8 – 5,2 nhằm kết hợp giữ cho amylase tiếp tục chuyển hoá tinh bột và dextrin thành đường lên men được. pH của nước quả thường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và vi khuẩn. Nếu pH thấp khoảng 3,0-4,0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế. pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm không đặc trưng về vị do dễ bị nhiễm
khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp và sản phẩm không đặc trưng về vị.
Nếu pH nhỏ hơn 4,2 thì nấm men phát triển chậm so với ở pH 4,5 – 5,0, tuy nhiên các tạp khuẩn hầu như không phát triển. Tới một lúc nào đó, nếu nấm men đã phát triển và vừa đủ mạnh thì ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn phát triển nhưng vì nấm men đã nhiều và đủ mạnh để lấn áp nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho nấm men.
Ta có thể điều chỉnh bằng acid citric hay dùng NaHCO3 để giảm hoặc tăng pH tuỳ thuộc dịch ép trái cây.
1.5.3. Nồng độ chất hòa tan của dịch lên men
Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men. Mặt khác nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển.
1.5.4. Thời gian
Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,… Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men.
1.5.5. Oxy
Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho nước ép tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích luỹ một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành rượu vi sinh vật phải được phát triển trong điều kiện hiếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức
chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men. Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân huỷ một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hoá thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có cồn nhiều thì không được thoáng khí môi trường. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hoá thành acid acetic làm sản phẩm bị chua
1.5.6. Nồng độ CO2 trong môi trường
CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường; một phần tách lên trên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường. CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi.
Theo Muler Turgar, với nồng độ 0,25% trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ ức chế sự sinh sản của nấm men rượu. Theo Smitener, sự sinh sản của nấm men ngừng lại khi nồng độ CO2 lên đến 1,5% trọng lượng. Lượng CO2 này tương ứng với áp suất 7,7 atm ở 15oC.
Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy, các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào.
1.5.7. Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men
Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng.
1.5.8. Hàm lượng giống nấm men
Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hoá đường thành etanol và khí carbonic. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau. Cùng loài nấm men,
nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì cũng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau. Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được lựa chọn.
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Nghiên cứu khoa học về Cacao, trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu. Từ tháng 9/2013 đến tháng 7/2014.
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
- Tủ cấy vô khuẩn có đèn UV;
- Kính hiển vi quang học OLYMPUS: Quan sát tế bào vi sinh vật;
- Nồi khử trùng (HIRAYAMA HV- Nhật Bản): Hấp khử trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm; - Cân phân tích; - Máy đo pH ; - Brix kế; - Buồng đếm hồng cầu; - Bộ chưng cất cồn; - Máy lắc ngang; - Tủ lạnh Sanyo;
- Bình lên men thủy tinh; - Bình lên men nhựng 500 ml; - Bình lên men nhựa 300 ml; - Pipetman, đèn cồn,...
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu a) Vật liệu chính a) Vật liệu chính
- Dịch quả Cacao được cung cấp từ trung tâm chuyển giao công nghệ Cacao Thành Đạt, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu;
- Giống nấm men: S1 và S2 được cung cấp từ viện kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh và viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội.
b) Hóa chất - Đường glucose; - Đường saccharose ; - Pepton ; - KH2PO4; - MgSO4.7H2O; - Agar ; - Xanh methylen; - Cồn 980; - NaHSO3; - Na2CO3.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tuyển chọn giống nấm men
Nấm men được lựa chọn đương nhiên là phải có đặc tính kỹ thuật phù hợp với sản xuất rượu vang. Sự đa dạng của đặc tính không chỉ phụ thuộc vào loại rượu mà còn phụ thuộc vào quan điểm khác nhau của những nhà chuyên môn.
Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóa hoàn toàn và có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vị không mong muốn thì ngày nay, do yêu cầu ngày càng cao, Saccharomyces cerevisiae cần phải có nhiều đặc tính khác, như liệt kê trong mục 1.3.2.
Tuy nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các chỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian. Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương pháp đơn giản và hiệu quả để chọn lựa nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chất công nghệ của nấm men vang. Phương pháp này chỉ bao gồm 2 bước:[11]
Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chịu đựng đối với SO , các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp;
Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.
2.2.2. Phương pháp huấn luyện giống thích nghi – nâng cao chất lượng giống
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng thích nghi rất cao đới với mọi tác động của môi trường. Những tác động vừa đủ của môi trường được lặp đi lặp lại nhiều lần tạo nên thích nghi bền vững. Tính thích nghi của vi sinh vật như là một biện pháp hữu hiệu để vi sinh vật tồn tại, pháp triển trong những điều kiện môi trường khác nhau. Dựa vào nguyên tắc trên ta có thể tạo ra giống tốt với điều kiện sản xuất công nghiệp.
Đối với quá đồ án này, giống thuần sau khi được tăng sinh trong môi trường nước khoai tây sau 24h sẽ được cho qua môi trường bán Cacao trước khi bổ sung vào dịch lên men.
2.2.3. Phương pháp phân tích a) Kiểm tra độ Brix a) Kiểm tra độ Brix
Sử dụng Brix kế. Dùng đũa khuấy khuấy nhẹ dung dịch cần đo nồng độ chất hòa tan, lấy ra một giọt chấm vào mặt kính. Đậy nắp kính lại. Quan sát và đọc độ Brix qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Xoay nhẹ ống kính để nhìn rõ nếu thấy thang đo bị mờ. Sau đó rửa lại kính bằng nước cất và lau khô nhẹ nhàng bằng giấy thấm.
b) Kiểm tra hàm lượng cồn
- Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa khối lượng của dung dịch rượu với nước cất ở cùng thể tích, trong cùng điều kiện, người ta xác định tỷ trọng của dung dịch rượu với nước. Từ giá trị tỷ trọng ta biết được nồng độ rượu trong dung dịch.
- Cách tiến hành:Lấy 50ml dịch trong sau lên men cho vào bình định mức 50ml, rót dịch vào bình cầu rồi tráng bình bằng 50ml nước cất rồi cũng đổ vào bình cầu dung tích 250ml. Nối bình với hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất và thu hồi nước ngưng vào bình định mức 50ml cho đến khi nước ngưng đầy tới ngấn 50ml. Cân bình tỷ trọng sạch và khô ta được trọng lượng bình m0. Sau đó đổ đầy nước cất,
từ từ đậy nắp sao cho không có bọt khí xuất hiện. Lau khô bình, cân được khối lượng