Thời gian đông máu của các loài tôm nước ngọt crayfish (Astacus astacus, A. leptodactylus và Orconectes limosus) dao động từ 4,27 đến 5,76 phút, khi máu được đặt
trong đĩa thủy tinh và sự đông máu được xác định bằng đũa thủy tinh [45]. Thời gian đông máu của tôm hùm dao động từ 52,7 đến 56 giây khi xác định bằng ống mao dẫn, trong điều kiện bất lợi khi giam giữ thời gian đông máu của tôm hùm tăng lên, thời gian đông máu tỷ lệ nghịch với THC [61]. Thời gian đông máu cũng thay đổi khi giáp xác bị nhiễm vi khuẩn hoặc môi trường nuôi bị ô nhiễm và được dùng như là một chỉ thị của stress ở giáp xác [61, 71, 90].
f. Thời gian lưu giữ Neutral red của màng lysosome
Neutral red (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride) là chất ít độc với tế bào và thử nghiệm neutral red retention assay (NRR) được dùng để đánh giá độ bền vững của màng lysosome. Lysosomes nằm trong tế bào bán hạt và tế bào hạt của nhiều động vật không xương sống, nó được giải phóng bởi quá trình phá vỡ hạt trong phản ứng miễn dịch [77, 102]. Khi vào huyết tương (plasma) của máu, men proteolytic trong lysosomes được giải phóng và tiêu diệt vi khuẩn [16, 36, 50]. Màu sẽ biến mất khi màng lysosome bị phá vỡ và men proteolytic được giải phóng [63]. Thực nghiệm đã chứng minh NRR có thể được dùng để đánh giá tình trạng stress và tình trạng miễn dịch của tôm hùm [51], tôm sú [110] và nhuyễn thể [96].
CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu:
1. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2012 đến 12/2012
2. Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được bố trí thực hiện tại trại thực nghiệm nuôi trồng Viện Hải Dương Học Nha Trang. Các thí nghiệm phân tích được tiến hành ở các phòng chuyên môn của Viện.
3. Đối tượng nghiên cứu: tôm sú Penaeus mondon Fabricius, 1798 giai đoạn hậu ấu trùng được nuôi lên giống cỡ 3 – 4 cm để bắt đầu tiến hành các thí nghiệm.
II.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu:
Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Tôm sú cỡ 3 – 4 cm
Tôm nuôi bằng thức ăn bổ sung MOS Tôm nuôi bằng thức ăn đối chứng
0,0 (%) MOS 0,1 (%) MOS 0,4 (%) MOS 0,8 (%) MOS
Thí nghiệm 2: Thí nghiệm về tác dụng của MOS với khả năng kháng
lại vi khuẩn Vibrio sp gây bệnh trên tôm sú
Thí nghiệm1: Thí nghiệm về tác dụng của MOS lên sức khỏe của tôm
Thảo luận, đánh giá kết quả và kết luận Tăng trưởng về khối lượng Xác định tỉ lệ sống Thông số sinh lý Thông số miễn dịch Sức khỏe hệ tiêu hóa Xác định tỉ lệ sống Thông số sinh lý Nồng độ vi khuẩn trong máu Tôm sau 8 tuần nuôi của thí nghiệm 1
0,2 (%) MOS
Tôm sử dụng thức ăn bổ sung 0,15% MOS Tôm sử dụng thức ăn đối chứng
Thông số
miễn dịch
II.3. Hệ thống bể thí nghiệm
Hệ thống bể nuôi tôm thí nghiệm gồm 15 bể composite bên ngoài sơn màu xanh, mặt trong mầu trắng để dễ dàng chăm sóc, theo dõi tôm hàng ngày. Các bể có hình chữ nhật, kích 500 x 700 x 1000mm, tương đương với công suất 300 lít/bể. Mỗi bể được gắn với một bộ lọc sinh học riêng biệt và hệ thống sục khí liên tục. Nước trước khi cấp vào bể nuôi được chạy qua hệ thống lọc cơ học và chảy tuần hoàn qua bộ lọc sinh học với tốc độ khoảng 3L/phút.
Hình 2.2: Hệ thống bể nuôi tại trại thực nghiệm Viện Hải Dương Học
Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ muối, độ kiềm, NO3, NO2- và NH3/NH4+
được kiểm tra định kỳ hàng ngày và hàng tuần để duy trì ở ngưỡng thích hợp cho sự phát triển của tôm sú nuôi.
II.4. Nguồn tôm thí nghiệm:
Hậu ấu trùng tôm sú (Postlarvae) 6 ngày tuổi được thu từ trại sản xuất giống thương mại Vina Company – Ninh Thuận và chuyển về trạm thực nghiệm nuôi trồng thủy sản – Viện Hải Dương Học. Tôm được nuôi khoảng 6 tuần đến khi đạt kích cỡ 3 – 4 cm
thì bắt đầu tiến hành thí nghiệm. Trong thời gian thuần hóa tôm được cho ăn thức ăn thương mại Unipresident (Đài Loan)
II.5. Chuẩn bị thức ăn thí nghiệm:
Thức ăn tôm thương mại UP (UniPresident, Đài Loan) có thành phần dinh dưỡng 40% đạm, 4% chất béo, 11% độ ẩm, 13% tro 3% chất xơ được sử dụng là thức ăn đối chứng (D1). Trong thí nghiệm, thức ăn UP được nghiền nát và bổ sung mannan oligosaccharide (MOS) (BioMos, Alltech) với hàm lượng 1g/kg ở nghiệm thức (D2), 2g/kg ở nghiệm thức (D3), 4g/kg ở nghiệm thức (D4), và 8g/kg ở nghiệm thức (D5). Hỗn hợp thức ăn và MOS được ép lại thành viên bằng hệ thống máy ép thức ăn tôm tại Trường Đại Học Nha Trang, sau đó phơi khô, để nguội và đóng bao để sử dụng nuôi thí nghiệm. Thức ăn được phân tích để kiểm tra thành phần dinh dưỡng như Protein tổng số, tro, lipid tổng số, độ ẩm theo phương pháp hóa sinh (AOAC, 2005) như: Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC 981.10, 991.20). Xác định hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Soxhlet (AOAC 920.39). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
II.6. Bố trí các thí nghiệm
Ảnh hưởng của MOS lên sức khỏe của tôm được đánh giá trên cơ sở các thông số về tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng, thông số sinh lý, thông số miễn dịch và khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh). 2 thí nghiệm được bố trí như sau:
+ Thí nghiệm 1: Mục tiêu của thí nghiệm là xác định được hàm lượng thích hợp của MOS bổ sung vào thức ăn cho tôm sú.
- Tôm sú cùng một nguồn gốc, có kích cỡ 3 – 4 cm được phân bố ngẫu nhiên vào 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 bể lặp lại với mật độ 30 con/bể, trong đó 1 nghiệm thức tôm được cho ăn thức ăn đối chứng D1 (0%) và 4 nghiệm thức tôm cho ăn thức ăn có bổ sung MOS ở các liều lượng khác nhau D2 (0,1%); D3 (0,2%); D4 (0,4%) và D5 (0,8%). Hàng ngày tôm được ăn hai lần vào 8 giờ sáng và 4 giờ chiều với liều lượng khoảng 10% khối lượng thân. Trước khi cho thức ăn mới, chất thải và thức ăn dư thừa được xiphông sạch sẽ khỏi đáy bể. Khoảng 10 - 20% nước mới được bổ sung hàng ngày sau khi vệ sinh bể.
Hình 2.3: Vệ sinh bể, chăm sóc tôm trong quá trình nuôi thí nghiệm
- Sau thời gian 21, 42, 63 ngày nuôi, tiến hành thu mẫu để đánh giá tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng của tôm đối chứng và tôm ở các nghiệm thức được ăn thức ăn bổ sung MOS. - Sau 63 ngày nuôi, 5tôm/bể (15con/nghiệm thức) được thu mẫu để xác định và so sánh các thông số về tình trạng sinh lý, thông số miễn dịch và hình thái của hệ thống tiêu hóa (thể hiện tình trạng sức khỏe của hệ tiêu hóa tôm) của tôm đối chứng và tôm ở các nghiệm thức được ăn thức ăn bổ sung MOS.
+ Thí nghiệm 2: Mục tiêu của thí nghiệm là xác định hiệu quả của MOS lên khả năng kháng lại vi khuẩn Vibrio alginolitycus gây bệnh phân trắng của tôm sú.
- Tôm sú cùng một nguồn, có kích cỡ 3 - 4cm được phân bố ngẫu nhiên vào 5 nghiệm thức thí nghiệm là nghiệm thức đối chứng D1 (0% MOS) và 4 nghiệm thức thức ăn bổ sung MOS D2 (0,1%); D3 (0,2%); D4 (0,4%) và D5 (0,8%). Hàng ngày tôm được ăn hai lần vào 8 giờ sáng và 4 giờ chiều với liều lượng 10% khối lượng thân. Trước khi cho thức ăn mới, chất thải và thức ăn thừa được xiphông sạch khỏi đáy bể. Khoảng 10 - 20% nước mới được bổ sung hàng ngày sau khi vệ sinh bể (kết quả của thí nghiệm 1).
- Sau 8 tuần nuôi tôm ở nghiệm thức đối chứng (D1) được phân bố ngẫu nhiên vào nghiệm thức 1 (gồm 6 bể), tôm ở các nghiệm thức bổ sung MOS (D2, D3, D4, D5) được phân bố ngẫu nhiên vào nghiệm thức 2 (gồm 6 bể). Tôm trong 3 bể ở nghiệm thức 1 được tiêm nước muối sinh lý để đánh giá tỉ lệ sống, thông số sinh lý, tôm trong 3 bể còn lại của nghiệm thức 1 và trong 6 bể của nghiệm thức 2 được cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio alginolitycus (một trong những tác nhân gây bệnh phân trắng ở tôm sú nuôi) để đánh giá
khả năng kháng lại vi khuẩn. Phương pháp cảm nhiễm là sử dụng 20 µl dung dịch vi khuẩn nồng độ 5.107 tb/ml (challenged control) tiêm vào xoang bụng của phần đầu ngực của tôm, nồng độ vi khuẩn này được tham khảo từ các thí nghiệm cảm nhiễm tôm với vi khuẩn của Fotedar et al, 2001, 2006; Sang et al, 2009, 2010. Sau khi cảm nhiễm, tôm được cho ăn thức ăn thương mại Unipresident (Taiwan) và thức ăn bổ sung 0,15% MOS. - Theo dõi dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ sống, thông số miễn dịch, nồng độ vi khuẩn trong máu tôm sau 1, 3 và 7 ngày cảm nhiễm.
- Xác định các thông số sinh lý sau 7 ngày cảm nhiễm.
II.7. Phân tích mẫu và thu thập số liệu - Các yếu tố môi trường:
+ Nhiệt độ đo 2 lần/ngày bằng nhiệt kế bách phân, độ chính xác 0,1oC. + Độ mặn đo 1 ngày/lần bằng Salikế, độ chính xác 1‰.
+ pH đo hàng ngày bằng máy đo pH hiệu PINPOINT (do American Marine Inc sản xuất), độ chính xác 0,01.
+ Hàm lượng nitrate, nitrite xác định bằng Nitrate-Test và Nitrit-Test hiệu Sera (sản xuất tại Đức).
+ Hàm lượng ammoniac xác định bằng Ammonium-Test hiệu SITTO, do tập đoàn SITTO Thái Lan sản xuất.
+ Độ kiềm xác định bằng hộp TOTAL ALKALINITY TEST, do công ty công nghệ Việt Mỹ sản xuất, độ chính xác 17 mg CaCO3/L.
- Việc xác định các thông số sinh lý, thông số miễn dịch, thông số sức khỏe của ống tiêu hóa được tiến hành tại các phòng nghiên cứu chuyên môn của Viện Hải Dương Học. - Định kỳ sau 21, 42, 63 ngày nuôi, tiến hành thu mẫu để xác định sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm nuôi
+ Tỷ lệ sống của tôm trong các bể nuôi được tính theo công thức: S = 100 x (nt/no)
Trong đó
S: là tỷ lệ sống
nt: là số lượng tôm tại thời điểm kiểm tra no:là số lượng tôm lúc bắt đầu thí nghiệm.
+ Tăng trưởng: Khối lượng của tôm được đo 3 tuần/lần trong tất cả các bể nuôi và tính tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR), mức độ tăng trưởng tuần (AGR) theo các công thức sau:
Tốc độ tăng trưởng đặc trưng về khối lượng toàn thân (%) SGRw = 100 x (lnWt – ln Wo)/t.
Mức độ tăng trưởng tuần:
AWG (g week-1) = (Wt - Wo)/wk Trong đó:
SGR là tốc độ tăng trưởng đặc trưng
Wt là khối lượng toàn thân tôm ở thời điểm kiểm tra
Wo là khối lượng toàn thân của tôm lúc bắt đầu thí nghiệm t và wk là số lượng ngày và tuần của thời gian thí nghiệm.
+ Thông số sinh lý của tôm: Các thông số đánh giá tình trạng sinh lý của tôm được xác định dựa trên phương pháp của Sang and Fotedar (2004): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần cơ của tôm (toàn bộ cơ của phần đuôi tôm) và tuyến gan tụy sẽ được cân để xác định chỉ số tuyến gan tụy ướt (Wet hepatosomatic Index: HSIwet) và chỉ số cơ đuôi ướt (Wet tail muscle Index: TMIwet) theo công thức sau:
HSIwet = Whwet x 100/W TMIwet = Wtwet x 100/W Trong đó:
Whwet: là khối lượng ướt của tuyến gan tụy tôm (g) Wtwet: là khối lượng của cơ phần bụng tôm (g) W: là khối lượng của tôm (g)
Toàn bộ tuyến gan tụy và cơ phần đuôi tôm được sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong 24 giờ (đến khối lượng không đổi). Độ ẩm của tuyến gan tụy (HM%), độ ẩm của cơ
(TM%), chỉ số tuyến gan tụy khô (HSIdry) và chỉ số cơ khô (TMIdry) được tính theo công thức: HM% = 100 x (Whwet – Whdry)/Whwet TM% = 100 x (Wtwet – Wtdry)/Wtwet HSIdry = Whdry x100/W TMIdry = Wtdry x 100/W Trong đó:
Whdry: là khối lượng khô của tuyến gan tụy (g) Wtdry: là khối lượng khô của cơ (g)
+ Thông số sức khỏe của hệ thống tiêu hóa:
Phân tích mô học ruột: Sử dụng phương pháp của Gen và cộng sự (2007). Ruột tôm được lấy ra và cố định trong dung dịch formol trung tính 4% ít nhất 24 giờ. Làm khô mẫu bằng cồn 70, 85 và 98%, đúc parafin và cắt bằng máy cắt microtom. Mẫu cắt (4- 5µm) sẽ được nhuộm màu bằng hematoxylin và eosin (H&E), mẫu nhuộm mô học được quan sát phân tích dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x40 lần.
+ Thông số hệ miễn dịch:
Tổng số tế bào máu (THC), tỷ lệ % các loại tế bào (Gc, SGc, Hyaline) và vi khuẩn trong máu tôm được xác định theo phương pháp của Foterdar (2004). Máu tôm được lấy từ gốc chân bò thứ 5 bằng syranh loại 1ml đã tiệt trùng có chứa dung dịch chống đông máu (1% glutaraldehyde trong 0.2 ml sodium cacodylate) theo tỷ lệ 1:1, sau đó chuyển máu vào ống nghiệm và bảo quản bằng đá lạnh.
Tổng số tế bào máu của từng cá thể tôm sú thử nghiệm được xác định bằng buồng đếm hồng cầu (Neubauer, Germany) ở độ phóng đại 100 lần. Tổng số tế bào máu được tính theo công thức:
THC = (số tế bào đếm được x hệ số pha loãng x 1000)/0,1mm3 (thể tích của ô vuông trên buồng đếm).
Để đếm và xác định tỷ lệ các loại tế bào máu của tôm, nhỏ 0,1 µl hỗn hợp máu có chứa chất chống đông lên lam kính và dùng lamen tạo phết mỏng. Phết máu được làm khô và cố định bằng methanol 70% trong 10 phút. Sau đó phết máu trên lam kính được nhuộm bằng thuốc nhuộm May-Grunwald và Giemsa (mỗi loại 10 phút) và đậy lại bằng lamen.
Đếm số lượng các loại tế bào trên mỗi lam kính phết máu. Tế bào hạt, tế bào bán hạt và tế bào hyaline được phân biệt trên cơ sở so sánh kích thước tế bào, kích thước nhân và số lượng hạt trong tế bào chất. Xác định tỷ lệ phần trăm từng loại tế bào trên cơ sở đếm mỗi loại tế bào.
Xác định tổng số vi khuẩn trong máu tôm: dùng syranh tiệt trùng loại 1ml rút 0.3 ml máu, nhỏ nhanh 100µl máu lên đĩa có môi trường dinh dưỡng Marine Agar (MA) và tạo phết máu. Đĩa được úp ngược cẩn thận trước khi đưa vào tủ cấy ở nhiệt độ 25oC trong 24 giờ. Số lượng khuẩn lạc (CFU/ml) trên đĩa máu được đếm và quy ra số lượng vi khuẩn của 1 ml máu tôm trên cơ sở tính thể tích của một giọt máu là 20µl. Mức độ nhiễm được xếp mức theo thang 13 bậc của Fotedar (2001): Bậc 1 từ 1 – 250 CFU/ml), đến bậc 12 (2751 – 3000 CFU/ml), bậc 13 là bậc có số lượng vi khuẩn nhiều và không thể đếm được.
Phân tích thống kê
Số liệu được phân tích bởi phần mềm SPSS for Windows phiên bản 17. Số liệu về tỷ lệ sống được chuyển sang dạng arcsin trước khi phân tích so sánh. Sự phân bố chuẩn của số liệu sẽ được đánh giá bằng phép thử Shapiro-Wilk test (Winer 1991) trước khi phân tích. Sự đồng nhất của biến được đánh giá bằng phép thử Levene test (Winer 1991) trước khi phân tích. Số liệu phân bố chuẩn sẽ được phân tích Analysis of Variance test (ANOVA) cho biến đồng nhất và Tamhane’s test (Winer 1991) cho biến không đồng nhất. Số liệu không có sự phân bố chuẩn sẽ được đánh giá bằng Kruskal-Wallis H test (Winer 1991). Sự khác nhau giữa các nghiệm thức thí nghiệm được xem ở mức ý nghĩa P ≤ 0,05.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Các yếu tố môi trường nước trong hệ thống bể nuôi tôm thí nghiệm
Hệ thống bể nuôi trong quá trình thí nghiệm được bố trí bằng các bể composite với công suốt 300 lít/bể, mỗi bể được gắn riêng một bộ lọc sinh học với hệ thống nước chảy tuần hoàn, hàng ngày tiến hành xiphông nhằm loại bỏ thức ăn dư thừa và chất thải, thay nước khoảng 20%. Nguồn nước được bơm từ biển qua hệ thống lọc thô, bể lắng xử lý và lọc tinh sau đó mới sử dụng để nuôi thí nghiệm. Qua đó đã duy trì được một số yếu tố môi trường như sau (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Một số yếu tố môi trường trong hệ thống bể nuôi thí nghiệm
Stt Yếu tố môi trường Hàm lượng
1 pH 7,7 – 8,3 Sáng 27 - 29 2 Nhiệt độ (oC) Chiều 28 - 30 3 Độ mặn (‰) 33 - 34 4 Độ kiềm (mgCa/L) 102 - 115 5 NH4+ (mg/L) 0,25– 0,4 6 NH3 (mg/L) 0,01 – 0,02 7 NO2-N (mg/L) 0,1 – 0,3 8 NO3- (mg/L) 15 - 20
Ghi chú: Giá trị thể hiện trên bảng là giá trị lớn nhất và nhỏ nhất.
Theo các giáo trình về kỹ thuật nuôi tôm sú như của Nguyễn Trọng Nho, Ngô Anh Tuấn, Tạ Khắc Thường, 1994… thì điều kiện môi trường tốt cho sự phát triển của tôm sú là pH = 7,3 – 8,5, to = 25 - 30oC, S‰ = 30 - 35‰…
Kết quả ở thí nghiệm này cho thấy các yếu tố môi trường luôn nằm trong khoảng thích hợp cho sự sinh trưởng của tôm sú, sự dao động trong ngày không lớn. Trong suốt thời gian thí nghiệm mức lớn nhất và nhỏ nhất cũng không chênh lệch nhau nhiều.