- Cuống nang và nang bào tử của Mucor sp.
c. Thao tác thí nghiệm
*Nhân bản sao 16S rDNA bằng ph ương pháp PCR
Thực hiện thí nghiệm 1: TT Hố chất Dung tích (µl) 1 DNA 1 2 Pre – mix 12 3 Primer 16S-5’ II 2 4 Primer Ana-3’ 2 5 KOD 1 6 Nước vơ trùng 32 Tổng thể tích 50
Máy PCR (Gene Amp PCR System 2400) Điều kiện cho thí nghiệm 1
940C 2 phút 940C 15 giây 600C 2 giây 40 vịng 680C 1 phút 40C Xác nhận bằng máy điện di Thực hiện thí nghiệm 2: TT Hố chất Dung tích (µl) 1 DNA 1 2 Pre – mix 12 3 Primer Ana-5’ 2 4 Primer 16S-3’ 2 5 KOD 1 6 Nước vơ trùng 32 Tổng thể tích 50
Máy PCR (Gene Amp PCR System 2400) Điều kiện cho thí nghiệm 2
940C 2 phút 940C 15 giây 600C 2 giây 40 vịng 680C 30giây 40C Xác nhận bằng máy điện di * Tinh chế sản phẩm bằng PCR
Đã xác nhận được sản phẩm mục tiêu. Tuy nhiên vạch sản phẩm với cặp mồi 16S-5’ II và Ana-3’ tương ứng với phần đoạn đầu 16S rDNA bị mờ. Do vậy sau khi tinh chế sản phẩm, sao cho cĩ độ tinh khiết cao, thì sử dụng 1 sản phẩm này làm khuơn để lập lại phản ứng PCR.Các sản phẩm PCR được tinh chế lần 2 bằng bộ kit QIA quick PCR Puritication.
Dãy trình tự TT Hố chất Dung tích (µl) 1 Terminator pre-mix 8 2 Premer(*) (5pmol) 1 3 Temlate DNA (200-300 ng) x 4 Nước vơ trùng 11-x Tổng thể tích 20
(*) Phần đầu 16S rDNA dùng cặp mồi 16S-5’ II và Ana-3’, Phần sau 16S rDNA dùng cặp mồi Ana-5’ và 16S-3’ để lập dãy trình tự gien
Máy PCR (Gene Amp PCR System 2400) 950C 20 giây
500C 15 giây 25 vịng 600C 1 phút
40C
+ Bổ sung 2 µl sodium acetate/ EDTA buffer và 80ml e tanol nồng độ 99%. Lắc rung mạnh trên máy Vortex
+Ủ 15 phút trong nước đá
+ Ly tâm (14.00rpm x 15 phút) ở nhiệt độ phịng + Thêm 300 µl êtanol nồng độ 70% ở nhiệt độ phịng + Ly tâm (14.00rpm x 5 phút) ở nhiệt độ phịng + Làm khơ chân khơng 5 phút
+ Bổ sung 20 µl TSR và lắc rung mạnh trên máy Vortex
+ Sử dụng toàn bộ 20 µl để dãy trình tự bằng máyABI PRISM 310 Genetic Analyzer
Máy PCR (Gene Amp PCR System 2400)
Trình tự dãy thu được đem kiểm chứng độ t ương đồng bằng [BLAST Search Results] của NCBI trên (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
d. Kết quả
* Kết quả PCR
Kết quả dãy trình tự: Kết quả dãy trình tự cho thấy đã thu nhận đượccả 2 phần đầu và phần sau của 16S rDNA. Nhưng bên trong phần nửa đầu 16S rDNA thiếu một đoạn trình tự khoảng 400bp.
5'- GGGAGGCTGCA---GAACCGGCAT……GTT-3'
Kết quả kiểm chứng độ t ương đồng về trình tự: Kết quả dưới đây cho thấy các trình tự thu được cĩ độ tương đồng cao với các chủng đ ược liệt kê trong bảng dưới đây Kết quả so sách trình tự thu được cĩ độ tương đồng với vùng 5' 16S rDNA (nửa đầu khoảng 300bp) và vùng 5' 16S rDNA (phần sau 3' khoảng 850bp).
Hình 1 Hình 2
Hình 1 Cho thấy đã thuđược vạch mục tiêu kích thước khoảng 700bp. Hình 2 Mặc dù cĩ sự hiện diện của vạch mục tiêu nhưng rất mờ. Do đĩ vạch này được ly trích khỏi gien và được ly trích dùng làm khung lập lại phản ứng PCR ở c ùng điều kiện. Hình 3 Cho thấy đã khuếch đại được
phần đầu của 16S rDNA
TT Chủng Vi khuẩn cĩ độ t ương đồng nhất (Số trong ngoặc là accession number trên GenBank)
Độ tương đồng(%)
Phần 300bp đầu 5’
1 Anaerobic ammoium–oxidizing planctomycet e KOLL2a (AJ250882) 1002 Uncultured anoxic sludge bacterium KU 1 (AB054007) 100 2 Uncultured anoxic sludge bacterium KU 1 (AB054007) 100 3 Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis 100 4 Candidatus Brocadia anammoxidans 95
Phần 850bp sau 3’
1 Anaerobic ammoium–oxidizing planctomycete KOLL2a (AJ250882) 1002 Uncultured anoxic sludge bacterium KU 1 (AB054007) 100 2 Uncultured anoxic sludge bacterium KU 1 (AB054007) 100 3 Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis 99 4 Candidatus Brocadia anammoxidans 94
Kết quả so sách trình tự thu được cĩ độ tương đồng với vùng 5' 16S rDNA (phần sau 3' khoảng 850bp).
e. Thảo luận
Kết quả phân tích cho thấy chủng anammox trong mẫu ở Việt Nam cĩ độ t ương đồng 100% với KOLL2a và KU2. Tuy nhiên do khơng thu được trình tự đoạn giữa 16S rDNA
Kết quả dãy trình tự cĩ độ tương đồng 100% sản phẩm nhân bản 16S rDNA bằng cặp mồi Ana-5' và Ana-3', cho thấy cĩ độ tương đồng cao 5 dịng là 100% KOLL2a và KU2 với 1 dịng cĩđộ tương đồng 99%. Do vậy cĩ thể cho rằng trong mẫu cĩ sự hiện diện của 2 loại Anammox. Mặt khác sản phẩm nhân bản 16S rDNA bằng cặp mồi 16S-5' II + Ana-3' và Ana-5' = 16S-3' cĩ độ tương đồng 100% với KOLL2a và KU2, kết quả này cho thấy chỉ cĩ một lồi anammox hiện diện trong mẫu. Tuy nhiên ở kết quả phân tích này trên sản phẩm PCR thu được dãy trình tựtrực tiếp cho nên dãy trình tự thu được chủng anammox cĩ mật độ thấp bị bỏ sĩt. Do vậy mặc dầu chủng anammox chiếm đa số cĩ độ tương đồng 100% với các chủng thuộc nhĩm chiếm ưu thế KOLL2a và KU2 cũng như cĩ sự hiện diện chủng anammox thiểu số cĩ sự tương đồng 99%. Nhưng do phân tích tồn bộ chiều dài của 16S rDNA nên chưa thể khẳng định được nhận định này.