- Cuống nang và nang bào tử của Mucor sp.
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN amylase,
amylopectin VÀ ĐẶC TÍNH CẦU TRÚC CỦA TINH BỘT
SẮN LÊN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA amylase
Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương,Viện Sinh họcNhiệt đới.
Nguyễn Kim Giao,Viện Vệ sinh dịch tễTrung ương
MỞ ĐẦU
Tinh bột được tạo thành từ amylose và amylopectin. Thành phần của hai loại polysaccharide này và cấu trúc tinh thể của tinh bột là những yếu tố rất quan trọng cĩ ảnh hưởng lớn đến tác dụng thủy phân của amylase. Ái lực của các amylase cũng phụ thuộc nhiều vào hình thể của phân tử cơ chất trong dung dịch (Park 1994). Một số tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần và cấu tạo của cơ chất lên quá trình thuỷ phân tinh bột ở dạng hồ hĩa cũng nh ư chưa hồ hĩa bằng amylase. Do tinh bột sống ch ưa hồ hố thường bền với tác dụng của amylase, chi phí cho hồ hố tinh bột b ằng nhiệt thường cao nên các nghiên cứu về thuỷ phân tinh bột ở dạng hạt sống đang là vấn đề được quan tâm (Pandey 2000, Forgaty 1990).
Những thay đổi về hình thái của hạt tinh bột dưới tác động của amylase cũng đã được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện t ử quét và hiển vi điện tử chuyển quang (Colona 1988, Paramahans 1982, Rendleman 2000, Sanoja 2000). Những sự thay đổi trên bề mặt hạt dường như cĩ liên quan tới cấu trúc xốp và kích thước các lỗ cho phép sự thâm nhập của enzyme. Tuy nhi ên đa số các nghiên cứu được thực hiện với tinh bột bắp và khoai tây, các thơng tin nĩi trên về tinh bột sắn - nguồn tinh bột rất dồi dào tại Việt Nam - cịn rất ít ỏi. Đặc biệt ở nước ta chưa cĩ một cơng bố nào liên quan đến đề tài này
Phần nghiên cứu dưới đây đề cập tới khả năng thủy phân của amylase đối với các dạng cơ chất amylose, amylopectin, dung dịch tinh bột sắn đã hồ hĩa cũng như tinh bột sắn dạng hạt chưa qua hồ hĩa. Bên cạnh đĩ, kính hiển vi điện tử quét (SEM) cũng đ ược sử dụng để khảo sát cấu trúc hạt tinh bột sắn, những thay đổi hình dạng của hạt khi bị amylase tấn cơng, cơ chế tấn cơng hạt tinh bột sắn của -amylase và GA cũng như khả năng hấp phụ của amylase lên bề mặt của hạt.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Tinh bột sắn của hãng Vedan, amylose và amylopect in tách từ tinh bột sắn theo phương pháp của Balagopalan (1988).
-amylase tinh sạch từ mơi trường lên men bán rắn của vi khuẩn B. subtilis, - amylase và glucoamylase (GA) tinh sạch từ mơi trường nuơi cấy bề mặt gạo lức các chủng nấm mốc A. oryzae và A. kawasaki (các chủng cĩ trong bảo tàng giống của Viện Sinh họcNhiệt đới).
Phương pháp
Thủy phân các dạng cơ chất khác nhau: Tinh bột sắn đã hồ hố, tinh bột sắn dạng hạt sống, amylose và amylopectin tách từ tinh bột sắn theo phương pháp của Balagopalan được chuẩn bị với nồng độ 1%, enzyme đ ược thêm vào với hàm lượng 15đv/1g cơ chất (-amylase), 20đv/1g cơ ch ất (GA) và sau đĩ thuỷ phân ở các điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp. Khả năng thuỷ phân c ơ chất được tính bằng phần trăm lượng đường khử tạo ra so với l ượng chất khơ ban đầu.
Thuỷ phân hạt tinh bột sống: Tinh bột sắn dạng hạt nồng độ 1% khơng qua hồ hố được thuỷ phân bằng các amylase nấm mốc và vi khuẩn tại những điều kiện pH và t0 tối ưu. Sau mỗi 2 giờ, mẫu được ly tâmở 12.000g trong 10 phút bằng thiết bị ly tâm Sigma 2K15. Lượng đường khử tạo ra trong phần dung dịch b ên trên được xác định bằng phương pháp so màu v ới thuốc thử DNS. Phần tinh bột cịn lại được rửa bằng cồn và nước cất vài lần, sau đĩ sấy đơng khơ hoặc sử dụng trực tiếp để kiểm tra các thay đổi về hình thái của hạt tinh bột bằng SEM.
Sử dụng kính hiển vi điện tử quét để quan sát sự biến đổi cấu trúc và những thay đổi hình dạng khác của hạt tinh bột: Cấu trúc hạt tinh bột và các thay đổi hình dạng khác của hạt dưới tác động của amylase được phân tích trên kính hiển vi điện tử thuộc phịng thí nghiệm SEM & EDS, Trung tâm Khoa học Vậtliệu, Khoa Vậtlý, Đại học Khoa học Tựnhiên, Hà Nội. Các hạt tinh bột được gắn lên đế mẫu bằng keo dán các bon cĩ tính dẫn điện và tiếp đĩ phủ một lớp vàng với chiều dầy 20nm bằng thiết bị Sputter JFC-1600. Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét JSM 5410 LV với điện áp 10-30kV.
Hấp phụ enzyme lên bề mặt hạt tinh bột: Enzyme được cho vào dung dịch tinh bột sắn nồng độ 10mg/ml với lượng 8,0 đv/1mg tinh bột trong đệm phosphate pH 5,7 đối với-amylase, 2,0 đv/1mg tinh b ột trong đệm acetate pH 4,5 đối với GA (Thí nghiệm 1) và 50mg protein/1mg tinh bột đối với cả hai 2 loại enzyme (Thí nghiệm 2). Hỗn hợp được lắc nhẹ ở 40C trong 1 giờ, sau đĩ ly tâm 10 phút ở 12.000g. Nồng độ protein và hoạt tính enzyme cịn lại trong phần dung dịch sau khi lắc với tinh bột sắn đ ược xác định và so sánh với nồng độ ban đầu để tính l ượng protein hấp phụ lên tinh bột. Khả năng enzyme hấp phụ lên bề mặt hạt tinh bột cũng đ ược kiểm tra bằng SEM.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khả năng thuỷ phân của amylase đối với các dạng c ơ chất khác nhau
Kết quả thuỷ phân các dạng c ơ chất khác nhau sau 3 giờ ở các điều kiện tối ưu thể hiện ở Bảng 1.
Bảng 1: Kết quả thuỷ phân các dạng tinh bột sắn bằng amylase từ các nguồn khác nhau
Lượng đường khử tạo ra (% so với l ượng cơ chất ban đầu) Cơ chất Termamyl 120L -amylase
(B. subtilis) -amylase (A. oryzae) GA Novo GA từ A. kawasaki Tinh bột sắn đã hồ hố 2,66 1,9 44,6 30,5 21,9 Tinh bột sắn chưa hồ hố 0,31 0,57 3,88 0,23 3,21 Amylose 0,49 0,31 44,4 25,0 10,9 Amylopectin 5,31 4,85 44,0 21,7 11,7
Pandey (2000) cĩ thơng báo về khả năng thuỷ phân kém các liên kết nhánh trong phân tử tinh bột của GA, cũng như việc sử dụng kết hợp GA và các enzyme như pullulanase hay isoamylase để tăng hiệu suất quá trình thuỷ phân. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, GA từ nấm mốc A. niger (hãng Novo) chỉ thuỷ phân amylopectin yếu h ơn một chút so với amylose, cịn GA từA. kawasaki thuỷ phân 2 cơ chất trên với tốc độ ban đầu gần như nhau. Các enzyme này thuỷ phân rất tốt tinh bột sắn đã hồ hố, lượng đường khử thu được khi thuỷ phân tinh bột sắn đã hồ hố cao nhất so với các cơ chất khác. GA từA. kawasaki thuỷ phân tinh bột sắn dạng hạt sống thấp hơn 7 lần so với tinh bột sắn đã hồ hố cịn GA từA. niger gần như khơng cĩ khả năng thuỷ phân dạng cơ chất này.
Do cơ chế tác động khác nhau mà các -amylase vi khuẩn bị chi phối nhiều h ơn bởi thành phần và tính chất của phân tử cơ chất. Kết quả cho thấy, đối với -amylase, khả năng thuỷ phân amylopectin là cao nhất và khả năng thuỷ phân hạt tinh bột sống là thấp nhất. Trong khi GA nấm mốc thuỷ phân amylose tốt h ơn một chút so với amylopectin thì-amylase vi khuẩn lại tấn cơng amylopectin với t ốc độ nhanh gấp 10 lần (Termamyl 120L) và 15 lần (-amylase từB. subtilis) so với amylose. Tốc độ thuỷ phân amylose rất thấp, tương đương với tốc độ thuỷ phân tinh bột sống ch ưa hồ hố.
Nếu như GA nấm mốc thuỷ phân tinh bột sắn đã hồ hố tốt nhất thì đối với cả 2 trường hợp sử dụng Termamyl và -amylase từ vi khuẩn B. subtilis, hàm lượng đường khử tạo ra khi thuỷ phân tinh bột sắn đã hồ hố chỉ bằng 1/2 lượng đường khử thu được khi cơ chất chỉ chứa amylopectin. Khả năng thuỷ phân tinh bột phụ thuộc vào tỷ lệ amylose, amylopectin trong thành phần; do hàm lượng amylopectin cao (85%) nên tinh bột sắn là một trong những loại tinh bột dễ bị thuỷ phân bởi -amylase. Termamyl 120L thuỷ phân yếu tinh bột sắn ch ưa hồ hố, khả năng thuỷ phân dạng c ơ chất này cao hơn đối với enzyme từ B. subtilis.
Cĩ thể thấy cơ chất mạch thẳng cĩ ái lực kém đối với -amylase vi khuẩn. Tuy nhiên độ phân nhánh của cơ chất lại khơng cĩ ảnh hưởng gì tới khả năng tấn cơng tinh bột sắn của -amylase từ nấm mốc A. oryzae. Hàm lượng đường khử tạo ra ở cả 3 trường hợp cơ chất tinh bột sắn đã hồ hố, amylose và amylopectin đều như nhau và đạt mức 450mg/ml, cao hơn nhiều so với lượng tạo ra bởi -amylase vi khuẩn. -amylase từ nấm mốc là enzyme đường hố với sản phẩm chính của quá trình thuỷ phân là maltose nên lượng đường khử tạo ra trong sản phẩm tinh bột sắn sau thuỷ phân cao. Kết quả trên cũng cho thấy 2 loại -amylase vi khuẩn và nấm mốc cĩ cơ chế tấn cơng phân tử cơ chất khác nhau. -Amylase từ nấm mốc A. oryzae cũng cĩ khả năng thuỷ phân tinh bột sắn chưa hồ hố khá tốt, tuy nhi ên lượng đường khử tạo ra cũng mới chỉ đạt 1/10 lượng đường khử tạo ra khi enzyme này thuỷ phân các dạng cơ chất khác.
Nghiên cứu tác động thuỷ phân của amylase đối với tinh bột sắn sống ch ưa hồ hố bằng
kính hiển vi điện tử quét.
Cấu trúc hạt tinh bột sắn
Các quan sát trên SEM về một số đặc điểm nh ư hình dạng, kích thước và cấu trúc bên trong hạt tinh bột sắn được thể hiện trong hình 1. Kết quả thu được về hình dạng và kích thước của hạt tinh bột sắn t ương tự như cơng bố của Balagopalan năm 1988.
Tinh bột sắn của hãng Vedan (chủ yếu thuộc giống sắn KM, đ ược trồng tại Tây Ninh, Phạm Văn Biên 2001) cĩ nhiều hình dạng, chủ yếu hình trịn và hình quả táo, cĩ một chỗ lõm và núm ở giữa (Hình A). Kích thước của hạt tinh bột n ằm trong giới hạn từ 5- 15mm. Bề mặt hạt tinh bột nhẵn (hình B), khi hạt tinh bột sắn bị vỡ, cĩ thể thấy các rãnh tạo cấu trúc xốp của hạt (Hình C). Các rãnh vơ định hình kéo dài từ bề mặt tới tâm của hạt tạo thành các lỗ xốp được Kossmann (2000) đề cập khá kỹ trong bài viết tổng quan về tinh bột. Chính các lỗ xốp n ày giúp nước thâm nhập làm trương nở tinh bột, phá vỡ các liên kết hydro giữa các phân tử trong cấu trúc tinh thể, tạo điều kiện cho tác dụng phân huỷ của enzyme. Tinh bột sắn cĩ cấu trúc hạt t ương đối xốp, liên kết giữa các phần tử trong cấu trúc tinh thể yếu, vì vậy nĩ dễ bị phân huỷ bởi các tác nhân nh ư acid, enzyme hơn so với các loại hạt khác nh ư bắp, gạo.
Khả năng thuỷ phân tinh bột sắn sống của amylase
Một số vi sinh vật cĩ khả năng tạo amylase thuỷ phân tinh bột sống khi đ ược nuơi bằng phương pháp bề mặt, trong khi enzyme thu đ ược khi nuơi bằng ph ương pháp bề sâu lại khơng cĩ hoạt tính này. Chính vì vậy, amylase thu được từ một số chủng cơng nghiệp của Viện SHNĐ khi nuơi cấy bề mặt đ ược sử dụng để nghiên cứu khả năng thuỷ phân tinh bột sắn sống chưa hồ hố. Dù khả năng thuỷ phân dạng c ơ chất này của amylase cĩ thể cịn thấp nhưng nĩ mở ra triển vọng giảm chi phí sản xuất v à đặc biệt là giúp đơn giản hố quy trình cơng nghệ.
-amylase từ vi khuẩn B. subtilis và nấm mốc A. oryzae (so sánh với Termamyl 120L) và GA từ nấm mốc A. kawasaki (so sánh với GA từ A. niger của hãng Novo) được sử dụng để thuỷ phân tinh bột sắn ch ưa hồ hố như đã mơ tả trong phần phương pháp. Dưới đây là các kết quả thuỷ phân được xác định dựa trên lượng đường khử tạo ra (Đồ thị 1) và bằng các quan sát trên kính hiển vi điện tử quét SEM (Hình 1).
Đồ thị 1: Lượng đường khử tạo ra khi thuỷ phân tinh bột sắn ch ưa hồ hĩa
0 1 2 3 4 5 6 0 2.5 5 7.5 10 15
Th êi gian , giê
§ ê n g k h ư , m g /m l B a c . su b tilis G A N ovo A sp. ory za e T e rm a m y l A sp. k a wa sa k i
A
B C
D E F
G H I
Hình 1: Hạt tinh bột khi bị các amylase tấn cơng.
A: Bề mặt hạt tinh bột sắn khi ch ưa bị enzyme tấn cơng, B: Hình dạng đặc trưng của hạt tinh bột sắn, C: Cấu trúc xốp bên trong hạt tinh bột sắn khi enzyme xâm nhập. D, E, F: Hạt tinh bột sắn bị tấn cơng bởi -amylase của nấm mốc A. oryzae, vi khuẩn B. licheniformis (Termamyl 120L) và B. subtilis. G, H, I: Hạt tinh bột sắn bị tấn cơng bởi GA của hãng Novo và GA củaA. kawasaki.
Theo kết quả trên đồ thị 1, cả 5 loại amylase sử dụng ít hoặc nhiều đều cĩ khả năng thuỷ phân hạt tinh bột sắn ch ưa hồ hố. Tuy nhiên, khả năng thuỷ phân của amylase từ các chủng vi khuẩn B. subtilis, A. oryzae và A. kawasaki của Viện SHNĐ - biểu hiện bằng lượng đường khử tạo ra trong phần dung dịch bên trên - đều cao hơn rất nhiều so với 2 enzyme đối chứng là Termamyl 120L và AGM 200L của hãng Novo, Đan Mạch.
Bên cạnh đĩ, kết quả quan sát trên SEM cho thấy, -amylase và GA tấn cơng hạt tinh bột theo hai cách khác nhau. -Amylase vi khuẩn tấn cơng hạt tinh bột sắn, tạo thành nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt, sau 24h thuỷ phân, bề mặt hạt bị rỗ nh ư tổ ong (Hình E và hình F tương ứng với hạt tinh bột sắn bị tấn cơng bởi Termamyl và -
amylase từ B. subtilis). Đối với -amylase từ nấm mốc A. oryzae, lượng đường khử tạo ra nhanh trong thời gian 3h đầu nh ưng sau đĩ, tác động thuỷ phân lên hạt tinh bột sắn tăng khơng đáng kể do -amylase nấm mốc chịu nhiệt kém h ơn so với -amylase vi khuẩn. Trong ba loại -amylase đã sử dụng enzyme từ B. subtilis cĩ tác dụng phá huỷ cấu hình hạt tinh bột sắn mạnh nhất.
GA từ các chủng Aspergillus sp. dường như khơng tấn cơng hạt tinh bột sắn theo
diện rộng bằng cách tạo nhiều lỗ nhỏ nh ư trong trường hợp của -amylase mà cĩ xu hướng tạo những lỗ lớn và sâu trên bề mặt hạt tinh bột (Hình G, H tương ứng với hạt tinh bột sắn bị tấn cơng bởi GA của hãng Novo và GA từ A. kawasaki). Lượng đường khử tạo ra trong dung dịch cao h ơn so với trường hợp sử dụng a-amylase vi khuẩn và đạt mức cao nhất 5,5mg/ml khi sử dụng GA từ A. kawasaki (Đồ thị). Trong hai loại GA, enzyme từ A. kawasaki cĩ khả năng thuỷ phân hạt tinh bột sắn mạnh hơn hẳn so với GA của hãng Novo, Đan mạch.
Theo thơng báo của Colonna (1988), enzyme tấn cơng tinh bột từng hạt một cịn acid thì lại tấn cơng đồng thời tất cả các hạt. Trong điều kiện thực nghiệm, các quan sát trên kính hiển vi điện tử cũng cho thấy, d ường như các amylase khơng t ấn cơng các hạt tinh bột sắn đồng thời cùng một lúc. Cĩ thể thấy nhiều hạt tinh bột với những dấu hiệu bị thuỷ phân rõ ràng bên cạnh những hạt tinh bột cịn gần như nguyên vẹn (Hình I). Tuy nhiên, kết quả trên cĩ thể được giải thích - một cách chính xác h ơn - bởi bản chất của “tính tiếp cận”, hay sự tiếp cận ch ưa đồng đều trong dung dịch; do phân tử lượng của amylase lớn h ơn acid quá nhi ều nên sự tiếp cận của phân tử enzyme với cơ chất bị hạn chế.
Khả năng hấp phụ của amylase lên bề mặt hạt tinh bột sắn
Kết quả nghiên cứu khả năng hấp phụ các amylase lên bề mặt hạt tinh bột sắn khi thủy phân chúng thể hiện ở bảng 2 và hình 2.
Bảng 2: Kết quả hấp phụ enzyme l ên bề mặt hạt tinh bột sau 30 phút
Nguồn enzyme % enzyme hấp phụ lên hạt tinh bột trong thí nghiệm 1
% protein hấp phụ lên hạt tinh bột trong thí nghiệm 2
Termamyl 120L Khơng hấp phụ Khơng hấp phụ
-amylase từ
B. subtilis
Khơng hấp phụ Khơng hấp phụ
-amylase từA. oryzae Khơng hấp phụ Khơng hấp phụ
GA từA. kawasaki 8,69 5,13
Hình 2: Các quan sát trên kính hi ển vi điện tử quét về hiện t ượng hấp phụ