- Cuống nang và nang bào tử của Mucor sp.
NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NHĨM VI KHUẨN anammo
PHÂN LẬP ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ
Lê cơng Nhất Phương, Ngơ Kế Sương, Nguyễn Tiến Thắng,
ViệnSinh họcNhiệt đới
Trần Linh Thước,
Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM
Kenji Furukawa, Phạm Khắc Liệu,
Kumamoto Universty, Japan
Takao FuJii
Sojo Universty, Japan.
MỞ ĐẦU
Để nghiên cứu về mặt phân tử, người ta dùng phương pháp xác đ ịnh cấu trúc DNA và RNA. Thí nghiệm được tiến hành dựa trên các mẫu lấy ra từ một hệ thống SBR (thiết bị phản ứng theo mẻ liên tục). Nhận thấy rằng hơn 70% sinh khối trong hệ thống được cấu tạo bởi một loại vi khuẩn cĩ thể dễ dàng nhận ra về mặt hình dáng. Những nỗ lực trong việc phân tích vi sinh vật theo cách truyền thống nhằm xác định cấu trúc phân tử của chúng đều bị thất bại. Sa u này, người ta dùng một phương pháp vật lý hiện đại, theo phương pháp này vi khu ẩn được phân tích từ hỗn hợp bằng cách ly tâm mẫu cho PCR.
Trình tự DNA của mẫu đem đi xác định rất giống với trình tự cấu trúc di truyền của planctomycete. Loại vi khuẩn mới được tìm thấy cĩ khả năng oxy hĩa đ ược ammonium trong điều kiện kị khí này, được đặt tên là Candidatus Brocadia Anammoxidans. Trình tự DNA đãđược xác nhận như đã nĩi ở trên sau này được dùng để dị tìm sự cĩ mặt của vi khuẩn này của các bộ (genera) anammo x tương tự trong các hệ thống xử lý n ước thải. Trong khi đĩ B. anammoxidans là loại vi khuẩn cĩ liên hệ khá gần với nĩ, Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis đã được tìm thấy trong nhiều hệ thống trên tồn thế giới và cĩ vẽ như đây là những loại vi khuẩn chính trong cộng đồng vi sinh cĩ mặt trong những hệ thống này.
Nhĩm Planctomycete cho đ ến nay bao gồm 4 bộ (genera) với 7 lo ài (species) đã được ghi nhận. Rất nhiều trình tự DNA được ghi nhận trong thực tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng cĩ thể cĩ những lồi khác thuộc về nhĩm Planctomycete này, một trong những lồi đĩ là vi khuẩn anammox. Trên thực tế cũng một loại vi khuẩn anammox cĩ tên là K. struttgartiensis vừa được tìm thấy lại được cho vào một nhĩm riêng biệt, vì theo cấu trúc DNA của nĩ cĩ sự gi ống nhau về mặt di truyền ít h ơn 90% so với Brocadia Anammoxidans đã nĩiở trên, điều này chứng tỏ sự khác nhau ở mức độ bộ (genera) giữa 2 loại vi khuẩn này.
Các thiết bị trong ngành kỹ thuật phân tử là những cơng cụ quan trọng để phát hiện sự cĩ mặt và theo dõi các hoạt động của vi sinh vật trong hệ sinh thái. Ví dụ nh ư tốc độ
sinh trưởng của nhiều loài vi khuẩn cĩ thể được suy ra từ nồng độ ribosome cĩ trong hệ thống đĩ. Tuy nhiên phương pháp này khơng áp dụng được cho những loài vi khuẩn sinh trưởng chậm như anammox và nitrosomonas. Trong trư ờng hợp này, nồng độ của precursor rRNA trong là một chất chỉ thị khá tốt cho các hoạt động sinh lý của c ơ thể. Do đĩ, đoạn RNA giữa vùng rRNA 16S và 23S được chọn để làm chất chỉ thị này (đoạn này được gọi là ISR). Các thí nghiệm với B. anammoxidans chứng tỏ một sự tương quan khá tốt giữa các hoạt động chuyển hĩa trong c ơ thể và nồng độ của ISR, điều này chứng minh được rằng đây là một phương pháp tốt để theo dõi và phát hiện các thay đổi trong hoạt động của vi sinh vật.
Kết quả đưa ra trong thí nghiệm cho thấy vi sinh vật cĩ thể thực hiện quá trình anammox cĩ thể hiện bằng việc làm giàu từ biofilm material (m àng cơ chất) của RBC in Kolliken. Mặc dù thí nghiệm khơng thực hiện với mơi tr ường thuần chủng, chúng ta xác minh được một cách nhanh chĩng 90% l ượng sinh vật là vi khuẩn anammox nhưng khĩ phân loại ra Candidatus B. anammoxidans. 16S rDNA sequence obtained for Kolliken vi khuẩn anammox cho thấy sự giống nhau về tỷ lệ cao nhất(giữa 98.5% và 98.9%) ở cấu trúc gen 16S rRNA của Candidatus K.sttuttartiensis, đ ược giả định là vi khuẩn anammox trong biofilm reactors ở Stuttgart (Schmid etal., 2000). Các cấu trúc khác từ Gen Bank đã cho thấy sự giống nhau về tỷ lệ thấp nhất (thấp h ơn 86%) ở cấu trúc của vi khuẩn Kolliken. Căn cứ vào 1 vài khảo sát về sự phát triển của cấu trúc đặc tr ưng ở vi khuẩn Candidatus B. anammoxidans và Candidatus K. stuttgartiensis, và căn c ứ vào một nhĩm khảo sát đặc trưng khác, chúng ta thấy được 90% cơ thể trong mơi trường làm giàu Kolliken cĩ gen 16rRNA được nhận dạng trong thí nghiệm. Mặc dù sự khác nhau đáng kể của cấu trúc 16S rDNA ở vi khuẩn B. anammoxidans và cơ th ể Kolliken (9.1%), nhưng đặc tính hình thái chính của chúng thì giống nhau. Trong phạm vi tế bào, 1 vùng giàu protein với lượng ribosomes chứa đựng thấp hơn so với vùng xung quanh được phát hiện khi soi kính hiển vi và bởi FISH.
Thêm nữa, các cơ thể anammox tập hợp lại kết thành khối khoảng hơn 350 tế bào (cho thấy từ electron microghaphs và FISH pictures, Figs. 2 và 3). Khi cấu trúc 16S rDNA của anammox từ Kolliken biofilm t ương tự như Candidatus K. stuttgartiensis (Schmid etal.,2000), điều này dường như thích hợp để gửi đến loại vi khuẩn Kolliken với dịng vi khuẩn Candidatus Kuenenia cùng loại. Hiển nhiên, điều này khơng rõ ràng khi cĩ 1 số khác biệt về thứ tự giữa 16S rDNAs của Candaditus K. stuttgartientsis và các vi khuẩn Kolliken đại diện cho sự khác biệt thật sự về phát sinh loài và sinh lý học. Tuy nhiên, bởi vì Candaditus K. stuttgartientsis khơng được làm giàu đến mức đơng đúc (sự đơng đức của chúng trong biofilm là 49%). Bất kỳ sự khác biệt về phát sinh loài giữa các loại vi khuẩn anammox Kolliken và Stuttgart vẫn cịn đang tranh luận. Các thí nghiệm về phát sinh lồi xác định rằng mơi trường Kolliken đã cho thấy được quá trình của vi khuẩn anammox. Sự sản xuất N2 diễn ra khi cĩ cả hai amoni v à nitrit và khơng cĩ oxy, ngư ợc lại khơng xảy ra khi chỉ cĩ ammonium hoặc nitrit. Sự oxy hĩa yếm khí của ammonium với nitrit cĩ thể được gây xúc tác bởi các chất oxy hĩa ammonium hiếu khí của lồi Nitrosomonas (Bock et al., 1995), mặc dù hoạt động xúc tác của những vi khuẩn này thấp hơn khoảng20 lầnso với Candidatus B. anammoxidan. Tuy nhiên, vì khơng cĩ một tế bào nào trong the Kolliken enrichment stained positively in FiSH with probes for Bet 42a (với
chất oxy hĩa ammonium cao nhất), Ntspa 662 hay Nit3(Table1), và một mơi trường được làm giàu cao (88% vi khuẩn anammox) được tìm thấy, với giả thuyết mạnh mẽ này thì khơng cĩ vi khuẩn oxy hĩa ammonium v à nitrit cơ bản tồn tại với một mật độ đáng kể trong mơi trường làm giàu.Hơn nữa,khi nồng độ nitrit được giữ ổn định, N2 sản xuất tăng theo một đường thẳng cùng với sự tiêu thụ ammoni nhanh chĩng.Bởi vậy,sự loại bỏ nitrit và sản xuất nitơ cĩ thể khơng được cho là sự khử nitơ, và ammoni bị loại bỏ cĩ thể được quy cho sự nitrit hĩa ở mức oxy hĩa thấp. Sự tồn tại của việc loại bỏ ammoni và nitrit với N2 được sản xuất cĩ thể chỉ cĩ 1 lý do giải thích là phản ứng anammox, được thực hiện do vi khuẩn anammox. Khoảng 15% nitrit bị xử lý và oxy hĩa thành nitrat, với sự theo dõi tương tự nhưCandidatus B. anammoxidans thì dường như cĩ sự phụ thuộc vào electron để làm giảm CO2 để sinh vật tự dưỡng phát triển (van de Graaf et al., 1996, Fit 1).Trong điều kiện cả hydroxylamine và hydrazin đều chuyển hĩa trong mơi trường, với sự hiện diện thống qua của hydrazin, quan sát thấy được hydroxylamine được tạo thêm, cĩ lẽ phụ thuộc vào sự khơng cân xứng.Các kết quả trên cho thấy phản ứng anammox của vi khuẩn Kolliken bắt nguồn từ Candidatus B. anammoxidans (van de Graaf et al., 1996). Tuy nhiên, cĩ lẽ nitrat khơng được tiêu thụ cho đến hết trong suốt quá trình cấy cùng với hydrazine và ammoni, và nitrat được tăng lên với sự phát triển của quá trình tự dưỡng,sự biến mất của nitrat trước đây được quan sát ở các mức thì khơng phụ thuộc vào quá trình anammox (Thamdrup và Daalsgard 2002; Mulder etal., 1995).