5. Thời gian
1.10.NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM
Viện Thú y Quốc gia đã hợp tác với Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) nhằm tăng cƣờng năng lực và trang thiết bị và kỹ thuật phát hiện, phân lập và giám định virus. Đến cuối tháng 8/2003 Viện Thú y đã có đủ khả năng về con ngƣời và vật liệu để xác định chủng H5 virus cúm gia cầm.
Viện Thú y lần đầu tiên chẩn đoán xác định sự có mặt của virus cúm gia cầm chủng H5 tại Việt Nam, là cơ sở khoa học để Bộ Nông nghiệp & PTNT công bố dịch vào ngày 8/1/2004.
Với sự giúp đỡ của CDC, chủng virus cúm gia cầm lƣu hành ở Việt Nam đƣợc xác định là chủng H5N1.
Chủng H5N1 không chỉ có mặt ở đàn gà mà còn gây bệnh cho cả ngan. Việc xác định virus H5N1 ở ngan đã cho thấy rằng thủy cầm cũng nhiễm bệnh và trở thành một trong những con đƣờng truyền lây quan trọng. Ngoài ra một số mẫu virus phân lập từ vịt thuộc loại H3N8.
Trƣớc những cảnh báo về nguy cơ bệnh cúm gia cầm có thể truyền cho lợn, tái tổ hợp ở vật chủ này rồi lây sang ngƣời, Viện đã lấy 188 mẫu dịch mũi lợn ở 3 tỉnh Hà Tây, Thái Bình, Hải Phòng tại vùng dịch đang xảy ra, đã xảy ra và xung quanh vùng dịch. Kết quả phân lập không phát hiện thấy virus cúm H5N1(Trƣơng Văn Dung và cộng sự, 2004) [10].
Qua phân tích trình tự nucleotide 8 đoạn ARN của 9 chủng virus cúm H5N1 từ ngƣời (2 chủng), chim cút (1 chủng), vịt (2 chủng), và gà (4 chủng) trong đợt dịch năm 2003 - 2004 và lập cây phả hệ, Bùi Tiến Dũng và cộng sự cho thấy, các chủng virus H5N1 lƣu hành ở Việt Nam đều giống nhau, có cùng nguồn gốc từ Trung Quốc và xuất phát từ một ổ dịch ban đầu (Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự, 2005) [13].
Một nghiên cứu khác của Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự trên đàn gia cầm của tỉnh Thái Bình và Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy, ngoài virus
cúm H5N1, đàn gia cầm còn nhiễm các loại virus typ A có kháng nguyên H3, H4, H6, H9, H11và H12 với tỷ lệ nhiễm khác nhau (Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2005) [14].
Một nghiên cứu khác của Viện Thú y về sự lƣu hành của virus trong đàn chim di cƣ qua việc phân tích 320 mẫu phân chim tại một số địa phƣơng trong đó có Vƣờn Quốc gia Xuân Thủy - Giao Thủy - Nam Định bằng phƣơng pháp RT - PCR, kết quả không phát hiện thấy virus cúm.
Khi dịch cúm gia cầm xảy ra, Lê Văn Năm đã cho biết về đặc điểm dịch tễ, các biểu hiện lâm sàng, đặc điểm bệnh lý ở gà, ngan, vịt, chim cút, gà tây, chim vẹt cảnh nhằm giúp cho việc chẩn đoán lâm sàng tại cơ sở thuận lợi hơn (Lê Văn Năm, 2004) [29].
Viện Thú y đã nghiên cứu thử nghiệm vacxin H5N2 của Intervet (Hà Lan); H5N2 và H5N1 của Trung Quốc. Kết quả cho thấy, vacxin tiêm cho đàn gia cầm đều đạt yêu cầu về độ tinh khiết, độ an toàn và hiệu lực theo đúng tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Đặc biệt vacxin H5N1 của Trung Quốc có thể tiêm cho đàn vịt có huyết thanh dƣơng tính vẫn đạt tỉ lệ bảo hộ tốt và an toàn.
Chƣơng 2
NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG
2.1.1. Một số đặc điểm của bệnh cúm gia cầm ở tỉnh Phú Thọ
Biến động tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo mùa vụ, theo phƣơng thức chăn nuôi, theo quy mô đàn, theo loại gia cầm tại tỉnh Phú Thọ (từ năm 2003 đến 2008).
2.1.2. Sự đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của đàn gà, vịt đƣợc tiêm vacxin H5N1 năm 2009 tiêm vacxin H5N1 năm 2009
- Giám sát huyết thanh và giám sát virus học của đàn gà trƣớc khi tiêm vacxin. - Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gà của tỉnh Phú Thọ và đàn gà thí nghiệm tại các thời điểm 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày sau tiêm vacxin H5N1.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn vịt của tỉnh Phú Thọ và đàn vịt thí nghiệm tại các thời điểm 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày sau tiêm vacxin H5N1 mũi 2.
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Đối tƣợng kiểm tra
Gà, vịt đã đƣợc tiêm phòng vacxin cúm H5N1 trên địa bàn tỉnh Phú Thọ.
2.2.2. Vacxin
Vacxin vô hoạt subtype H5N1, chủng Re - 1 (A/Harbin/Re - 1/2003).
2.2.3. Các hoá chất dùng trong xét nghiệm
* Môi trường và hoá chất bảo quản bệnh phẩm
- Môi trƣờng Glycerol Pha chế PBS:
NaCl 8g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g
Nƣớc cất vđ 1000 ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hấp vô trùng 121oC/ 15 phút, bổ xung kháng sinh có trộn với glycerol
theo tỷ lệ 1:1.
* Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh
- Dung dịch PBS 0,01M, pH 7,2
Na2HPO4 1,096 g
NaH2PO4.H2O 0,316 g
Na Cl 8,5 g
Nƣớc cất 1000 ml
Chỉnh pH = 7,2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản
4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch nước muối sinh lý 0,85 %:
Pha 8,5 g NaCl trong 1000 ml nƣớc cất. Hấp vô trùng, bảo quản 4oC
không quá 3 tuần.
- Dung dịch hồng cầu gà 1 %:
+ Máu gà trống khoẻ mạnh đã trƣởng thành, không có kháng thể kháng virus cúm và Newcastle.
+ Dùng bơm tiêm 5 - 10ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4 %) rồi lấy máu gà vào ống nghiệm.
+ Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, gạn bỏ huyết tƣơng,
cho thêm nƣớc sinh lý (NaCl 0,85 %) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm nhƣ trên
3 - 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối gạn bỏ nƣớc ở trên.
+ Pha hồng cầu với nƣớc muối sinh lý thành huyễn dịch 1 %: pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nƣớc muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8o
pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng).
* Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn của các loài nhƣ thỏ, dê, cừu... cần đƣợc xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trƣớc khi xét nghiệm.
- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng thì kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là dƣơng tính.
- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý
của yếu tố ức chế đặc hiệu kháng huyết thanh vô hoạt.
- Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh, ủ ở nhiệt độ 37oC
trong nồi đun cách thuỷ qua đêm.
- Ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ56oC/30 phút để vô hoạt RDE còn dƣ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội, cho thêm 6 phần nƣớc sinh lý (0,3ml HT + 1,8ml SL), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10.
2.2.4. Các trang thiết bị và cơ sở vật chất
Các trang thiết bị và cơ sở vật chất của phòng virus- Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW, Chi Cục Thú y tỉnh Phú Thọ [8].
2.3.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Điều tra một số chỉ tiêu liên quan đến chăn nuôi và dịch cúm gia cầm của tỉnh Phú Thọ cầm của tỉnh Phú Thọ
Tôi thu thập số liệu của Cục Thống kê, Chi Cục Thú y tỉnh Phú Thọ.
2.3.2. Giám sát một số chỉ tiêu của đàn gia cầm sau tiêm phòng vacxin H5N1 của tỉnh Phú Thọ H5N1 của tỉnh Phú Thọ
Dựa theo hƣớng dẫn qui chế giám sát sau tiêm phòng, chúng tôi tiến hành giám sát đàn gia cầm sau khi tiêm vacxin ngoài thực địa [6].
2.3.2.1. Giám sát lâm sàng
- Khảo sát độ an toàn của vacxin đối với đàn gia cầm sau mỗi lần tiêm
một đàn vịt thuộc 3 huyện trên địa bàn tỉnh.
2.3.2.2. Giám sát huyết thanh
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn gà trong tỉnh và gà thí nghiệm đƣợc tiêm vacxin H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày. Đàn gà thí nghiệm là đàn gà của một hộ gia đình trong tỉnh do thú y cơ sở tiêm và đƣợc nuôi dƣỡng, chăm sóc giống nhƣ các đàn gà khác trong tỉnh.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn vịt trong tỉnh và vịt thí nghiệm đƣợc tiêm vacxin H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày. Đàn vịt thí nghiệm là đàn vịt của một hộ gia đình trong tỉnh do chúng tôi trực tiếp tiêm đàn vịt này và đƣợc nuôi dƣỡng, chăm sóc giống nhƣ các đàn vịt khác trong tỉnh.
2.3.2.3. Lấy mẫu
Phƣơng pháp lấy mẫu huyết thanh:
Đối tƣợng lấy mẫu là huyết thanh gà, vịt đƣợc tiêm vacxin H5N1 đang đƣợc nuôi tại tỉnh Phú Thọ.
Nhổ hết lông tại vị trí lấy máu (mặt dƣới cánh). Sát trùng bằng bông cồn cho nổi rõ tĩnh mạch cánh. Dùng bơm tiêm loại 5ml, chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hƣớng đầu kim vào phía trong cơ thể gia cầm, lấy từ 2-3ml máu/con, sau đó kéo dài pittong ra đến 5ml, bẻ gập đầu kim, đậy nắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên, chắt lấy huyết thanh.
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C (bảo quản trong hộp xốp
đựng đá)trong vòng 48 giờ, nếu bảo quản lâu hơn, giữ ở nhiệt độ - 200C.
Mẫu huyết thanh đƣợc vận chuyển tới phòng xét nghiệm của Trung tâm chẩn đoán thú y trung ƣơng trong điều kiện lạnh (phích đá) càng sớm càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
* Gà, vịt chỉ báo: Gà, vịt trên địa bàn tỉnh Phú Thọ không đƣợc tiêm vacxin cúm H5N1, dùng để làm đối chứng. Chúng tôi lấy mẫu huyết thanh của gà, vịt chỉ báo là 10 mẫu/ 1 huyện qua các thời điểm (30, 60, 90, 120, 150) sau
tiêm để kiểm tra hiệu giá kháng thể. Từ đó rút ra kết luận đàn gà, vịt trong tỉnh có hiệu giá kháng thể là do miễn dịch tự hiên hay miễn dịch do vacxin.
2.3.2.4. Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA
- Nhỏ 25 l PBS 0,01M vào đĩa TaKaShi 96 giếng chữ V từ giếng thứ
1 đến giếng thứ 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 l huyết thanh vào giếng thứ 1.
- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25 l dung dịch huyết
thanh từgiếng thứ 1 sang giếng thứ 2và tuần tự đến giếng 11 thì bỏ đi 25 l.
- Nhỏ thêm 25 l PBS vào các giếng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhỏ 25lhồng cầu gà 1 % vào tất cả các giếng trên.
- Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay
- Để đĩa TaKaShi ở nhiệt độ phòng 20oC, thời gian khoảng 20 - 30 phút.
- Đọc kết quả:Hiệu giá HA của virus đƣợc tính ở độ pha loãng cao nhất
vẫn có hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu.
Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng1/128 còn có ngƣng kết thì hiệu giáHA là 1/128.
+ Nếu HA (+) dƣơng tính, chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập (Bộ
NN và PTNT, 2005) 4.
2.3.2.5. Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Theo Bộ NN và PTNT (2005), 4, cách tiến hành phản ứng HI nhƣ sau:
- Pha kháng nguyên 4HA/25l: lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng
ngƣng kết hồng cầu nhân với 4.
- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 đĩa TaKaShi có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtype khác nhau.
+ Nhỏ 25 l PBS vào các giếng của đĩa TaKaShi.
+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 l kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25lcuối cùng.
+ Nhỏ 25 l kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng
1 - 11. Thêm 25 l PBS vào hàng đối chứng hồng cầu(giếng 12).
+ Lắc đĩa và để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút.
+ Nhỏ 25ldung dịch hồng cầu (1 %) vào tất cả các giếng của đĩa
+ Lắc đều, để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút.
- Đọc kết quả: phản ứng (+) dƣơng tính hồng cầu lắng xuống đáy. Nhƣ
vậy, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tƣơng ứng với nhau.
Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông Nghiệp
và Phát Triển Nông Thôn: ngƣỡng bảo hộ hiệu giá (HI) = 4 log2.
kháng thể cao hiệu giá (HI) > 4 log2.
không đƣợc bảo hộ hiệu giá (HI) < 4 log2.
2.3.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
- Cách tính hiệu giá kháng thể: Hiệu giá HI của mẫu đƣợc tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có khả năng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu hoàn toàn. Độ pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, tức là: lần 1 là 1/2 tƣơng
ứng với(1log2), lần 2 là 1/4 tƣơng ứng với 2log2, lần 3 là 1/8 tƣơng ứng với
3log2, lần 4 là 1/16 tƣơng ứng với 4 log2…. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu huyết thanh sau khi tiêm vacxin cúm gia cầm có HGKT ≥ 4 log2
đƣợc coi là đạt mức bảo hộ.
Công thức tính tỷ lệ bảo hộ cá thể/tổng đàn:
Một đàn nếu có TLBH ≥ 70 % thì đƣợc coi là đƣợc bảo hộ đàn.
- Xử lý số liệu bằng phƣơng pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel. Số mẫu đạt HGKT bảo hộ
Tổng số mẫu
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH CÚM GIA CẦM Ở TỈNH PHÚ THỌ PHÚ THỌ
3.1.1. Tình hình bệnh cúm gia cầm từ cuối năm 2003 đến nay
Chúng tôi đã tiến hành điều tra tỷ lệ gia cầm mắc bệnh cúm H5N1 của tỉnh Phú Thọ từ năm 2003 đến thời điểm tháng 10 năm 2009. Kết quả điều tra đƣợc thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1: Tỷ lệ gia cầm mắc bệnh cúm tình từ năm 2003 - 2009
Năm Tổng số gia cầm
của năm (con)
Số gia cầm mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc ( %) Cuối 2003- đầu 2004 9.784.785 125.786 1,28 2005 10.074.490 14.319 0,14 2006 9.075.685 0 0,00 2007 9.125.423 370 0,004 2008 8.421.900 2.038 0,0024 2009 8.930.900 0 0,00 Tổng 55.413.183 142.513 0,26
Tạitỉnh Phú Thọ, dịch cúm ra cầm bắt đầu xảy ra cùng với dịch cúm
trong phạm vi toàn quốc. Dịch bắt đầu xẩy ra rất mạnh từ cuối năm 2003 - đầu năm 2004, dịch xảy ra bất ngờ làm cho số gia cầm bị chết và tiêu huỷ là 125.786 con chiếm 1,28 % số gia cầm trên địa bàn của tỉnh. Từ khi dịch xảy ra, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn đã tích cực đề ra các biện pháp phòng và chống bệnh. Trong đó, biện pháp tích cực nhất là tiêm phòng và vệ
sinh phòng bệnh. Tuy nhiên vẫn không thanh toán đƣợc bệnh vì đây là một bệnh truyền nhiễm có tính chất lây lan nhanh. Đến năm 2005 dịch lại bùng phát trở lại, số gia cầm bị mắc bệnh và chết là 14.319 con, chiếm tỷ lệ 0,14 %. Trong đợt dịch này, do đã có sự chủ động trong phòng bệnh nên số gia cầm bị mắc bệnh và chết cũng ít hơn so với năm 2004. Năm 2006 thì không bị dịch bệnh xảy ra. Năm 2007, dịch lại xảy ra làm cho số gia cầm bị mắc bệnh và
tiêu huỷ là 370 con (chiếm tỷ lệ 0,004 %). Năm 2008, dịchtiếp tục phát ra làm
số gia cầm mắc bệnh, bị chết và tiêu huỷ là 2.038 con, chiếm tỷ lệ 0,024 %. Từ đầu năm 2009 đến nay chƣa có một ổ dịch cúm nào xảy ra.
Nhƣ vậy, nhìn tổng quan từ cuối năm 2003 đến nay, toàn tỉnh Phú Thọ đã xảy ra 4 đợt dịch cúm gia cầm (năm 2003 - đầu 2004; 2005 xảy ra 2 đợt; năm 2007, năm 2008). Trong đó, đợt dịch cuối năm 2003 - đầu 2004 xảy ra nặng nề nhất. Vì số gia cầm bị mắc bệnh và buộc phải tiêu huỷ là lớn nhất. Do dịch xảy ra bất ngờ nên các địa phƣơng không kịp đề ra biện pháp đối phó kịp