Cỏc nghiờn cứu tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào cỏc biểu hiện lõm sàng, cận lõm sàng và đỏnh giỏ hiệu quả điều trị của một số chế phẩm thay thế FVIII.
Năm 1991, Bạch Quốc Tuyờn nghiờn cứu đề tài “Nhõn một trƣờng hợp hemophilia A cú khỏng thể khỏng FVIII- Bàn về: vấn đề khỏng thể khỏng đụng lƣu hành”. Đề tài mụ tả một trƣờng hợp cú khỏng thể khỏng
FVIII trong quỏ trỡnh điều trị và bƣớc đầu nghiờn cứu về sự hỡnh thành khỏng thể khỏng FVIII [12].
Năm 1993, Tỏc giả Trần Ngọc Trõn nghiờn cứu điều chế và sử dụng tủa lạnh giàu yếu tố VIII trong điều trị bệnh hemophilia A. Đõy là giai đoạn phỏt triển của quỏ trỡnh điều trị tại Việt Nam khi cú thể tự điều chế chế phẩm điều trị thay thế cú nồng độ FVIII cao hơn và an toàn hơn [96].
Nguyễn Thị Hƣơng Quế cú đề cập tới những tỏc dụng khụng mong muốn ở bệnh nhõn hemophilia ngƣời lớn đƣợc truyền cỏc chế phẩm mỏu từ năm 2004 đến 2008 [7]. Cú một số đề tài nghiờn cứu cỏc lĩnh vực khỏc của hemophilia nhƣ tổn thƣơng khớp, đỏnh giỏ hiểu biết của ngƣời nhà bệnh nhõn về bệnh hemophilia.
Năm 2008, trong những nghiờn cứu tiờn phong về bệnh hemophilia A ở mức độ phõn tử nhúm nghiờn cứu tại Trung tõm Nghiờn cứu Gen-Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội đó thành cụng trong việc tỏch dũng gen mó húa yếu tố VIII của ngƣời bỡnh thƣờng. Đồng thời, nhúm nghiờn cứu cũng đó thành cụng trong việc tạo ra FVIII bị xúa vựng gen B và vẫn giữ nguyờn hoạt tớnh. Nhúm nghiờn cứu đó thiết kế vector, biểu hiện và tinh chế thành cụng FVIII ngƣời trờn đối tƣợng E.coli, vector thuộc hệ retrovirus mang gen mó FVIII tỏi tổ hợp cũng đó đƣợc thiết kế thành cụng mở đƣờng cho cỏc nghiờn cứu ứng dụng liệu phỏp điều trị gen sau này ở Việt Nam [97].
Hiện nay, nghiờn cứu xỏc đột biến gõy bệnh hemophilia A tại Việt Nam là rất ớt. Viện Huyết học truyền mỏu, trong một đề tài cấp Bộ y tế đang nghiờn cứu xỏc định đảo đoạn intron 22 và intron 1 trờn bệnh nhõn hemophilia A. Tuy nhiờn, nghiờn cứu này sử dụng phƣơng phỏp LD-PCR để xỏc định đột
biến đảo đoạn intron 22, phƣơng phỏp này khú thực hiện, thời gian điện di lõu. Nghiờn cứu này cũng chỉ tập trung sàng lọc nhúm bệnh nhõn thể nặng, khoảng 50% bệnh nhõn khụng cú đột biến đảo đoạn intron sẽ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến.
Trong nghiờn cứu của Phạm Quang Vinh và cộng sự, bƣớc đầu đó ứng dụng phƣơng phỏp PCR-RFLP với vị trớ cắt của enzym BclI tại intron 18 để chẩn đoỏn ngƣời mang gen bệnh trong gia đỡnh bệnh nhõn hemophilia A. Phƣơng phỏp này dựa trờn cơ sở cú nhiều đột biến DNA trờn gen F8 khụng gõy bệnh, những đột biến này là cỏc chỉ điểm để phỏt hiện cỏc trƣờng hợp mang gen bệnh. Tuy nhiờn đõy cũng chỉ là phƣơng phỏp phỏt hiện giỏn tiếp, khụng phỏt hiện đƣợc vị trớ đột biến thực sự gõy bệnh hemophilia A [98].
1.5. NHỮNG VẤN ĐỀ CếN TỒN TẠI
Khụng cú kỹ thuật sinh học phõn tử nào cú thể xỏc định đột biến ở 100% bệnh nhõn hemophilia A. Một số đột biến nằm trong gen F8 khụng phõn tớch đƣợc bằng những kỹ thuật phõn tớch đột biến hiện nay. Phƣơng phỏp giải trỡnh tự DNA của toàn bộ gen F8, cú thể đƣợc coi là "tiờu chuẩn vàng" để xỏc định cỏc đột biến điểm vẫn khụng thể phỏt hiện đột biến trong mọi trƣờng hợp. Theo nghiờn cứu của Goodeve năm 2008, tỉ lệ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm 2-7% tổng số bệnh nhõn hemophilia A [5].
Tại Italy, khi Margaglione và cộng sự nghiờn cứu trờn 1.296 bệnh nhõn hemophilia A, chỉ cú 1.153 trƣờng hợp phỏt hiện đột biến chiếm tỉ lệ 89%. Tỷ lệ này cú thể thay đổi tựy theo tớnh chớnh xỏc trong chẩn đoỏn lõm sàng và hiệu quả phỏt hiện đột biến [51].
Trong nghiờn cứu này, do điều kiện thời gian, trang thiết bị mỏy múc và kinh phớ hạn hẹp chƣa thể phối hợp hết cỏc kĩ thuật sinh học phõn tử hiện đại để chẩn đoỏn đột biến gen F8. Tuy nhiờn, phƣơng phỏp I-PCR phỏt hiện đột biến đảo đoạn intron 22, kết hợp với kĩ thuật giải trỡnh tự toàn bộ 26 exon để phỏt hiện đột biến là phƣơng phỏp mới nhất, thụng dụng nhất để sàng lọc phỏt hiện đột biến ở bệnh nhõn hemophilia A trong giai đoạn hiện nay.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIấN CỨU
- Nhúm đ i chứng: 20 ngƣời (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đỡnh
khụng cú ngƣời mắc bệnh di truyền. Nhúm chứng đƣợc dựng để chuẩn húa kỹ thuật và làm mẫu đối chứng cựng với mẫu nghiờn cứu khi thực hiện cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử để phõn tớch gen.
- Nhúm nghiờn cứu: 103 bệnh nhõn đƣợc chẩn đoỏn xỏc định hemophilia
A tại viện Nhi Trung ƣơng và viện Huyết học truyền mỏu Trung ƣơng.
Tiờu chuẩn chẩn đoỏn hemopphilia A:
+ Lõm sàng:
- Chảy mỏu: Chảy mỏu khú cầm sau chấn thƣơng, va chạm hay chảy mỏu tự nhiờn.
- Vị trớ: Chảy mỏu trong khớp, cơ hoặc một số vị trớ khỏc. - Tớnh chất: Thƣờng chảy mỏu tỏi phỏt.
- Tiền sử: cú tiền sử chảy mỏu kộo dài hoặc trong gia đỡnh cú ngƣời thõn bị chảy mỏu khú cầm.
+ Cận lõm sàng: - APTT kộo dài.
- Định lƣợng FVIII giảm dƣới 30%. - Thời gian mỏu chảy bỡnh thƣờng.
- Số lƣợng tiểu cầu và độ tập trung tiểu cầu bỡnh thƣờng. - Prothrombin bỡnh thƣờng.
- Yếu tố von Willebrand bỡnh thƣờng.
Tiờu chuẩn loại trừ :
+ Bệnh nhõn mắc bệnh Von-Willebrand.
+ Cỏc bệnh lý di truyền gõy kộo dài APTT: giảm yếu tố XI, XII, prekallikrelin.
Tiờu chuẩn xỏc định cú khỏng thể khỏng FVIII:
- Xột nghiệm Mixtest (là xột nghiệm để xỏc định sự cú mặt của chất ức chế): trộn huyết tƣơng bệnh nhõn với huyết tƣơng của ngƣời bỡnh thƣờng với tỷ lệ 1:1 và ủ trong 2 giờ ở 37°C. Đo thời gian APTT của ngƣời bỡnh thƣờng và APTT của mẫu trộn sau 2 giờ. Nếu APTT ở mẫu mỏu trộn kộo dài hơn mẫu ngƣời bỡnh thƣờng là cú khỏng thể trong mỏu bệnh nhõn.
- Xột nghiệm Bethesda (là xột nghiệm đo nồng độ chất ức chế): 1 đơn vị Bethesda là lƣợng khỏng thể cú thể trung hoà 50% của 1 đơn vị FVIII thờm vào ủ trong 2 giờ ở 37 độ C.
Chẩn đoỏn c khỏng thể khỏng VIII: xột nghiệm Mixtest dƣơng tớnh và định
lƣợng cú khỏng thể khỏng VIII bằng xột nghiệm Bethesda.
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HểA CHẤT NGHIấN CỨU
2.2.1. Dụng cụ
- Ống Eppendorf 1,5 mL; 0,5 mL; 0,2 mL
- Ống lấy mỏu chống đụng EDTA
- Mỏy Gene Amp PCR System 9700 (USA)
- Pipet, đầu cụn cỏc loại
- Tủ lạnh sõu: -30°C; -80°C (SANYO) - Mỏy điện di: Mupid (Nhật Bản)
- Mỏy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Mỏy ly tõm lạnh Beckman (USA) và ly tõm để bàn Eppendorf (Đức) - Lũ vi súng
- Mỏy đọc trỡnh tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ)
2.2.2. Hoỏ chất
* Húa chất dựng để tỏch chi t DNA:
- Dung dịch Lysis buffer
- Dung dịch SDS 10% - Dung dịch K
- Proteinase K
- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl (tỷ lệ 25 : 24 : 1) - Dung dịch chloroform: isoamyl ( tỷ lệ 24 : 1)
- Sodium acetate 3M, pH=5,2 - Ethanol 100%; ethanol 70% * Hoỏ chất để thực hiện kỹ thuật PCR
+ Buffer 10x + dNTP 10 mM + Taq polymerase + Cỏc cặp mồi * Hoỏ chất để điện di sản phẩm PCR + Agarose + Dung dịch TBE 10X + Loading buffer 10X + Ethidium bromide * Hoỏ chất để đọc trỡnh tự gen
BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems) gồm BigDye Terminator v3.0 (dATP, dCTP, dGTP và dUTP), BigDye buffer, cặp mồi đặc hiệu, dung dịch formamide.
* Húa chất để tinh sạch DNA
- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1 - Dung dịch chloroform: isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100%; ethanol 70% - Hũa tan bằng nƣớc tinh khiết
* Húa chất để cắt DNA:
+ Enzym BclI + Buffer BclI
* Húa chất để n i DNA:
+ T4 ligate
+ Buffer T4
2.2.3. Trỡnh tự mồi cho cỏc phản ứng PCR
- Trỡnh tự mồi của phản ứng Inversion – PCR xỏc định đột bi n đảo đoạn intron 22 của gen F8 [78]
Tờn mồi Trỡnh tự
ID (mồi xuụi trong gen F8) ACATACGGTTTAGTCACAAGT IU (mồi ngƣợc trong gen F8) CCTTTCAACTCCATCTCCAT ED (mồi xuụi ngoài gen F8) TCCAGTCACTTAGGCTCAG
- Trỡnh tự mồi của phản ứng PCR xỏc định đột bi n đảo đoạn intron 1 của gen F8 [99]
Tờn mồi Trỡnh tự
9F GTTGTTGGGAATGGTTACGG
9cR CTAGCTTGAGCTCCCTGTGG
Int1h-2F GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
Int1h-2R TGGGTGATATAAGCTGCTGAGCTA
- Trỡnh tự mồi của phản ứng PCR khu ch đại 26 exon của gen F8
Thiết kế 38 cặp mồi riờng biệt để khuếch đại 26 exon David 1994 [100]. Trong đú exon 14 cú kớch thƣớc lớn nhất 3,1 kb nờn cần 9 cặp mồi; exon 26 kớch thƣớc cần 5 cặp mồi để khuếch đại toàn bộ cỏc exon này.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Sơ đồ nghiờn cứu
Cỏc kiểu hỡnh khỏc nhau trờn lõm sàng đƣợc chứng minh là do cỏc dạng đột biến khỏc nhau gõy nờn. Dựa vào đặc điểm này, chỳng tụi thiết kế mụ hỡnh xỏc định đột biến của cỏc thể hemophilia A nhƣ hỡnh 2.1:
- Đối với bệnh nhõn thể nặng, do đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm đa số nờn đầu tiờn cần tiến hành xỏc định hiện tƣợng đảo đoạn intron 22 bằng phƣơng phỏp inversion PCR. Khụng phỏt hiện đƣợc đột biến đảo đoạn intron 22 ta tiến hành tiếp trờn intron 1 bằng phƣơng phỏp multiplexPCR xem cú hiện tƣợng đột biến đảo đoạn intron 1 hay khụng. Nếu vẫn khụng xỏc định đƣợc thỡ ta khuếch đại toàn bộ 26 exon tỡm đột biến mất exon. Nếu cỏc exon đều lờn vạch tƣơng ứng kớch thƣớc DNA ngƣời bỡnh thƣờng thỡ phõn tớch đột biến điểm trờn 26 exon hoặc tại cỏc vị trớ nối bằng phƣơng phỏp giải trỡnh tự. Cỏc vị trớ đột biến xỏc định đƣợc sẽ xõy dựng bản đồ gen F8.
- Đối với những bệnh nhõn thể vừa và thể nhẹ do khụng bị đột biến đảo đoạn nờn chỉ sử dụng phƣơng phỏp PCR khuếch đại 26 exon tỡm đột biến, nếu khụng cú đột biến mất exon thỡ giải trỡnh tự gen trực tiếp để phỏt hiện cỏc dạng đột biến điểm. Cỏc vị trớ đột biến xỏc định đƣợc sẽ xõy dựng bản đồ gen F8.
2.3.1. Qu trỡnh lấ mẫu
Bệnh nhõn đó chẩn đoỏn hemophilia A đƣợc lấy 5 mL mỏu tĩnh mạch, cho vào ống chống đụng bằng EDTA với hàm lƣợng 1,5 mg/mL. Quy trỡnh lấy mỏu đảm bảo vụ trựng tuyệt đối.
2.3.2. Quy trỡnh tỏch chi t DNA từ mỏu ngoại vi
- Mỏu tƣơi chống đụng EDTA cần tỏch trong vũng 24 giờ.
- Cho 0,5 mL mỏu tƣơi toàn phần chống đụng bằng EDTA vào ống Eppendof 1,5 mL, thờm vào 0,5 mL dung dịch Lysis buffer rồi ủ trờn đỏ trong 10 phỳt.
- Ly tõm 8000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt ở 4oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn. quỏ trỡnh này đƣợc lặp lại 3 lần.
- Cho vào 0,5 mL dung dịch K, ly tõm 10 phỳt tốc độ 8000 vũng/ phỳt ở 4 oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn.
- Cho 0,5 mL Lysis buffer; 12,5 àL SDS 10%; 10 àL proteinase K, sau đú ủ 2h ở 56 o
C.
- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 oC, hồn hợp đƣợc chia làm 3 phần: lớp dung dịch phớa trờn cú chứa DNA, lớp ở giữa là cặn tế bào, lớp dƣới cựng là dịch chiết. Hỳt lấy phần dịch chứa DNA trờn cựng.
- Cho 0,5 mL chloroform: isoamyl, ly tõm mẫu ở 10.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 o
C, hỳt lấy phần dịch trờn cựng.
- Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thờm 50 àL sodium acetat, để lạnh ở -20 o
C trong 4 giờ.
- Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 20 phỳt ở 4 oC, đổ dịch nổi phớa trờn, thu tủa. - Rửa tủa bằng cồn 70 oC. Tủa DNA đƣợc hoà tan bằng 30 mL nƣớc tinh khiết. Phõn tử DNA thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng phỏp đo mật độ quang ở bƣớc súng 260/280 nm và điện di trờn gel agarose 0,8%.
+ Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thỡ DNA đƣợc coi là tinh sạch.
+ Chất lƣợng của DNA tốt khi điện di cho vạch rừ nột, băng gọn. Ngƣợc lại, phõn tử DNA bị đứt góy, lẫn nhiều protein hoặc cỏc tạp chất khỏc thỡ hỡnh ảnh điện di là một vệt trải dài khụng tạo thành băng gọn.
2.3.3. Qu trỡnh phỏt hiện đảo đoạn intron
2.3.3.1. Kỹ thuật Inversion – PCR xỏc định đột biến đảo đoạn intron 22 của gen F8
Phản ứng multiplex PCR với trỡnh tự ba mồi đƣợc thiết kế dựa vào trỡnh tự hệ gen ngƣời và vị trớ của enzym cắt BclI đó đƣợc chứng minh bằng phƣơng phỏp Southern Blot PCR.
Hỡnh 2.2. Vị trớ của enz m cắt BclI và cỏc mồi IU, ID, ED.
int22h2/3 ED
BclI BclI
Cỏc mồi IU, ID, ED đƣợc thiết kế cú chứa trỡnh tự enzym cắt giới hạn
BclI nằm ở hai đầu của int22h1 và một đầu của int22h2/3 (hỡnh 2.2).
Sau khi cắt sản phẩm DNA bằng enzyme cắt giới hạn BclI, 2 đầu DNA đƣợc nối lại bằng enzyme T4 ligate sẽ cho 2 sản phẩm DNA vũng cú kớch thƣớc 21,5 và 20 kb.
Hỡnh 2.3. Cỏc đoạn DNA đúng vũng sau khi n i bằng T4 ligate
Ở ngƣời bỡnh thƣờng, mồi IU bắt cặp với mồi ED tạo ra DNA đúng vũng kớch thƣớc là 21,5 kb; chứa đoạn int22h1 ở vựng BX842559 trờn Genebank, cú vị trớ của enzyme cắt giới hạn BclI: base 36204 trờn mồi IU và base 14595 trờn mồi ID (hỡnh 2.3.A). Khi khuếch đại bằng phản ứng multiplex PCR sẽ cho đoạn DNA cú kớch thƣớc 487 bp.
Khi hiện tƣợng đảo đoạn xảy ra, đoạn int22h1 nằm trong gen F8 đƣợc thay thế bằng đoạn int22h2 hoặc int22h3 nằm ngoài gen F8 cỏch đầu telomere 500kb, do đú DNA vũng cú kớch thƣớc là 20 kb (hỡnh 2.3.B). Lỳc này mồi IU sẽ bắt cặp với mồi ED (mồi ED đƣợc thiết kế nằm cạnh int22h2 và intron 22h3 cú chứa trỡnh tự enzym cắt giới hạn BclI). So sỏnh trỡnh tự mồi ED trờn Genbank ở vựng BX 276110 thấy vị trớ BclI trờn int22h3 là base 14703 và
DNA ngƣời bỡnh thƣờng
đúng vũng 21,5kb đoạn đúng vũng 20,0kb DNA bệnh nhõn đảo
int22h1 int22h2/3 IU 487 bp ID 460 27 BclI BclI IU 559 bp ED 460 99 BclI BclI B A
vựng BX 683327 cú vị trớ BclI trờn int22h2 là base 15265. Đột biến đảo đoạn sẽ khuyếch đại đoạn DNA cú kớch thƣớc 559 bp.
Sản phẩm sau khi khuếch đại đƣợc điện di trờn gel agarose 1,5% với marker 100bp và nhuộm bởi ethidium bromid để kiểm tra đột biến đảo đoạn. Quy trỡnh kỹ thuật gồm 3 bƣớc theo mụ tả của Rosetti và cộng sự [78]:
Bƣớc 1: Cắt DNA bằng enzym BclI: Thành phần phản ứng Thể tớch (l) Enzym BclI 1,2 Buffer BclI 10X 3,0 DNA 4,0 Nƣớc cất PCR 21,8 Tổng thể tớch 30,0 Ủ ở 500 C trong 4h. Tinh sạch sản phẩm cắt:
- Cho 0,2 mL Phenol: Chloroform: Isoamyl và 0,3 mL nƣớc tinh khiết vào 30L sản phẩm sau khi cắt. Trộn đều sau đú ly tõm 15000 vũng/phỳt trong 5 phỳt ở 4 oC. Hỳt lấy phần dịch chứa DNA trờn cựng.
- Cho 0,5 mL chloroform: isoamyl, ly tõm mẫu ở 10.000 vũng/phỳt trong 5 phỳt ở 4 o
C, hỳt lấy phần dịch trờn cựng.
- Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thờm 50 àL sodium acetat, ly tõm 15.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 oC, đổ dịch nổi phớa trờn và thu tủa.
- Rửa tủa bằng cồn 70 oC. Tủa DNA đƣợc hoà tan bằng 20 mL nƣớc tinh khiết. Phõn tử DNA thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng phỏp đo mật độ quang ở bƣớc súng 260/280 nm.
Bƣớc 2: Nối DNA bằng T4 ligate: Thành phần phản ứng Thể tớch (l) T4 ligate 3,0 Buffer T410X 4,0 DNA 20,0 Nƣớc cất PCR 13,0 Tổng thể tớch 40,0 Ủ ở 160