2.3.6.1. Tinh sạch DNA (sử dụng Kit QIAGEN)
- Cho 500 àl dung dịch PB vào ống chứa 100 àl plasmid, lắc đều, để ở nhiệt độ phũng 30 phỳt.
- Hỳt hết dịch cho qua cột tinh sạch (do hóng Qiagen cung cấp). - Quay ly tõm 10000 v/p trong 30 giõy, đổ bỏ dịch ở đỏy ống. - Cho tiếp 750 àl PE vào cột.
- Ly tõm tiếp thờm 60 giõy để loại bỏ hết dịch trong cột. - Lấy cột ra, cho vào ống eppendorf 1,5 mL.
- Cho 50 àl dung dịch EB (gồm 10 mM Tris-Cl, pH 8,5).
- Để ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt, ly tõm 10000 v/p trong 60 giõy. - Dịch thu đƣợc ở đỏy ống là dịch chứa DNA đó đƣợc tinh sạch.
2.3.6.2. Quy trỡnh thực hiện giải trỡnh tự gen:
Thực hiện theo qui trỡnh và sử dụng phƣơng phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).
+ Giai đoạn 1: Chuẩn bị master mix cho phản ứng giải trỡnh tự gen
- Chuẩn bị effendorf 0,2ml đó đỏnh dấu sẵn thứ tự cỏc mẫu - Chuẩn bị húa chất để thực hiện phản ứng
- Làm tan hoàn toàn húa chất, trộn đều sau đú ly tõm nhẹ để toàn bộ dịch trờn nắp ống rơi xuống
- Tiến hành pha master mix theo bảng sau:
Thành phần Thể tớch (l)
Sản phẩm sau PCR đó đƣợc tinh sạch 1,0
Big Dye Buffer 5X 3,0
Big Dye terminator V3.1 (2,5X) 2,0
Nƣớc cất 13,0
Mồi đơn (5pmol/àl) 1,0
Tổng 20
Chỳ ý:
- Toàn bộ khõu chuẩn bị master mix phải đƣợc thực hiện trờn khay đỏ - Cỏc húa chất phải đƣợc làm tan và trộn đều trƣớc khi sử dụng
- Big dye 2,5X phải đƣợc bảo quản trỏnh ỏnh sỏng
- Mỗi DNA thực hiện hai phản ứng với mồi xuụi và mồi ngƣợc + Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng sequencing
- Sau khi chuẩn bị master mix cho phản ứng xong, ly tõm nhanh cỏc ống PCR để toàn bộ dịch dớnh trờn thành và nắp ống xuống dƣới và làm tan bọt.
- Xếp cỏc ống master mix vào mỏy PCR
- Chọn chƣơng trỡnh nhiệt đó đƣợc cài đặt sẵn trong mỏy theo chu trỡnh đó đƣợc tối ƣu húa.
- Kiểm tra lại toàn bộ chu trỡnh nhiệt:
Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp
1 96oC - 1 phỳt
2 – 26 96oC - 10 giõy 50oC - 5 giõy 60oC - 4 phỳt
Bảo quản ở 10oC
- Ấn nỳt “Start” cho mỏy bắt đầu chạy chƣơng trỡnh.
- Sau khi chạy xong chƣơng trỡnh đƣa mỏy về chế độ nghỉ và tắt mỏy - Lấy mẫu ra khỏi mỏy PCR
- Cỏc sản phẩm sau khi đƣợc khuếch đại bằng Big dye kit sẽ đƣợc tinh sạch bằng big Dye temination để loại bỏ toàn bộ big dye thừa và đem đọc trờn mỏy giải trỡnh tự gen ABI (Applied Biosystem)
- Cỏc nucleotid trờn gen sẽ đƣợc biểu hiện bằng cỏc đỉnh (peak) với 4 mầu tƣơng đƣơng với 4 loại nucleotid A,T,G,C
2.3.7. Phƣơng phỏp phõn tớch k t quả
So sỏnh trỡnh tự gen của bệnh nhõn với trỡnh tự gen chuẩn của Gen Bank (National center for biotechnology information, NCBI) NC_000023.11 bằng phần mềm CLC.
So sỏnh trỡnh tự cỏc acid amin của bệnh nhõn với trỡnh tự acid amin chuẩn của Genebank NP_000123.1 bằng phần mềm Blast của NCBI. Trong đú alanine là acid amin đầu tiờn của protein F8 trƣởng thành đƣợc đỏnh số 01. 19 acid amin trƣớc đú bắt đầu từ methionin bị loại bỏ trong quỏ trỡnh hoàn thiện protein F8 khụng đƣợc đỏnh số.
Khi phỏt hiện vị trớ nghi ngờ đột biến, tỡm cỏc vị trớ đột biến tƣơng ứng trờn cơ sở dữ liệu HAMSTeR và CDC. Nếu đột biến đó cụng bố thỡ khẳng định bệnh nhõn cú đột biến gõy bệnh. Trƣờng hợp đột biến ở bệnh nhõn chƣa thấy cụng bố thỡ phõn tớch tiếp khả năng gõy bệnh dựa trờn phần mềm cấu trỳc khụng gian 3D DNASTAR.
2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIấN CỨU
- Bệnh nhõn sẽ đƣợc thụng bỏo kết quả xỏc định vị trớ đột biến gen thụng qua bỏc sĩ điều trị.
- Bệnh nhõn cú trỏch nhiệm cung cấp đầy đủ cỏc thụng tin liờn quan đến tỡnh hỡnh bệnh tật của mỡnh.
- Cỏc xột nghiệm phõn tớch gen chỉ thực hiện khi cú sự đồng ý của bệnh nhõn. - Cỏc thụng tin về bệnh nhõn, kết quả chẩn đoỏn đƣợc hoàn toàn giữ bớ mật. Nghiờn cứu đƣợc tiến hành hoàn toàn vỡ mục đớch khoa học, khụng vỡ bất kỳ mục đớch nào khỏc.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC ĐỐI TƢỢNG NGHIấN CỨU
3.1.1. Đặc điểm về tuổi
Trong nghiờn cứu này, do bệnh nhõn chủ yếu là nam giới bị bệnh nờn cú 101/103 bệnh nhõn nam giới chiếm tỷ lệ 98,1%. Tuy nhiờn trong quỏ trỡnh thu thập mẫu, hai nữ giới cú đầy đủ cỏc triệu chứng chảy mỏu, cú nồng độ yếu tố VIII thấp đƣợc chẩn đoỏn hemophilia A tại viện Nhi và viện Huyết học – Truyền mỏu trung ƣơng đảm bảo tiờu chuẩn lựa chọn mẫu. Nhƣ vậy, nữ giới chiếm tỷ lệ 1,9%.
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi của cỏc đ i tƣợng nghiờn cứu
Đặc điểm n Tỷ lệ % Tuổi phỏt hiện bệnh Dƣới 1 thỏng 3 2,9 1-6 thỏng 36 34,9 > 6 thỏng-12 thỏng 32 31,1 > 12 thỏng -24 thỏng 19 18,4 > 24 thỏng 13 12,6 Chẩn đoỏn trƣớc sinh 0 0 trung bỡnh (X± SD)(thỏng) 32 ± 10,6 Tuổi trung bỡnh bệnh nhõn (X ± SD) (Năm) 8,2 ± 5,1 Nhận xột:
Cú 36/103 bệnh nhõn hemophilia A đƣợc phỏt hiện bệnh ở lứa tuổi 1 – 6 thỏng chiếm tỷ lệ cao nhất (34,9%); 32/103 bệnh nhõn đƣợc phỏt hiện bệnh ở
lứa tuổi 7 - 12 thỏng chiếm tỷ lệ 31,1%; 19/103 bệnh nhõn đƣợc phỏt hiện bệnh ở lứa tuổi 12 - 24 thỏng chiếm tỷ lệ 18,4%; 13/103 bệnh nhõn đƣợc phỏt hiện bệnh ở lứa tuổi 12 - 24 thỏng chiếm tỷ lệ 12,6%; 3/103 bệnh nhõn đƣợc phỏt hiện bệnh ở lứa tuổi dƣới 1 thỏng chiếm tỷ lệ 2,9% và khụng cú bệnh nhõn nào đƣợc phỏt hiện bệnh nhờ chẩn đoỏn trƣớc sinh.
3.1.2. Tỷ lệ bệnh nhõn chia theo thể bệnh Biểu đồ 3.1. Phõn b tỷ lệ bệnh nhõn theo thể bệnh Nhận xột: 81/103 bệnh nhõn đƣợc chẩn đoỏn lõm sàng thể nặng chiếm tỷ lệ 78,6%; 15/103 bệnh nhõn thể trung bỡnh chiếm tỷ lệ 14,6%; 7/103 bệnh nhõn thể nhẹ chiếm tỷ lệ 6,8%.
3.2. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8
3.2.1. Tỷ lệ phỏt hiện đƣợc đột bi n
3.2.1.1. Tỷ lệ bệnh nhõn theo kết quả phỏt hiện đột biến
Nghiờn cứu phỏt hiện đƣợc 92/103 trƣờng hợp bệnh nhõn cú đột biến gen F8 gõy bệnh hemophilia A, chiếm tỷ lệ 89,3%. Số bệnh nhõn chƣa phỏt hiện đƣợc 11/103 trƣờng hợp, chiếm tỷ lệ 10,7%, bao gồm: HA14, HA27, HA32, HA35, HA43, HA48, HA52, HA58, HA60, HA66, HA69.
3.2.1.2. Tỷ lệ đột biến theo thể bệnh ở nhúm phỏt hiện và khụng phỏt hiện được đột biến
Biểu đồ 3.2. Phõn b tỷ lệ phỏt hiện đột bi n theo thể bệnh
Nhận xột:
- 73/81 bệnh nhõn thể nặng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỷ lệ 90,1%; 8/81 bệnh nhõn thể nặng khụng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỷ lệ 9,9%.
- 13/15 bệnh nhõn thể trung bỡnh phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỷ lệ 86,7%; 2/15 bệnh nhõn thể trung bỡnh khụng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỷ lệ 13,3%.
- 6/7 bệnh nhõn thể nhẹ phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỷ lệ 85,7 %; 1/7 bệnh nhõn thể nhẹ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỷ lệ 14,3%.
3.2.2. K t quả phỏt hiện cỏc dạng đột bi n gen F8 ở bệnh nhõn hemophilia A
3.2.2.1. Kết quả xỏc định đột biến đảo đoạn
a/ Xỏc định đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ thuật Inversion –PCR
81 bệnh nhõn hemophilia A chẩn đoỏn lõm sàng thể nặng đƣợc xột nghiệm đột biến đảo đoạn intron 22 bằng phƣơng phỏp Inversion –PCR. Kết quả cú 35/81 bệnh nhõn cú đột biến đảo đoạn chiếm tỉ lệ 43,2% bệnh nhõn thể nặng.
Hỡnh 3.1. Hỡnh ảnh điện di sản phẩm PCR xỏc định đột bi n đảo đoạn intron 22
Nhận xột:
DNA ngƣời bỡnh thƣờng ở mẫu đối chứng dƣơng (+) khi đƣợc khuếch đại bằng phản ứng multiplex PCR cú 1 băng kớch thƣớc tƣơng ứng 487 bp. Nếu đột biến xảy ra, khi khuếch đại sẽ cho 1 đoạn kớch thƣớc 559 bp. Nhƣ vậy, ở vị trớ cỏc giếng tƣơng ứng với cỏc bệnh nhõn mó số HA33, HA38 khụng cú đảo đoạn intron 22 do cựng cú vạch DNA kớch thƣớc 487 bp. Ở giếng mó số HA02, HA07, HA12, HA20, HA73 là bệnh nhõn hemophilia A cú đột biến đảo đoạn intron 22 (hỡnh 3.1) do điện di đều cú vạch DNA kớch thƣớc 559 bp.
Để đảm bảo chớnh xỏc cỏc vạch DNA trờn đỳng là đoạn DNA cần tỡm, gel cú chứa đoạn DNA kớch thƣớc 559 bp, kớch thƣớc 487 bp ở mẫu bệnh nhõn trỡnh tự nucleotid HA02 và HA33 đƣợc cắt để tinh sạch rồi giải trỡnh tự sau đú kiểm tra sosỏnh với trỡnh tự Genebank (hỡnh 3.2). Kết quả cỏc đoạn gen kiểm tra cú đầy đủ trỡnh tự vị trớ bỏm của mồi, trỡnh tự của enzym BclI và cỏc vị trớ này tƣơng ứng với cỏc vị trớ đó đƣợc Rossetti và cộng sự cụng bố [78].
Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh giải trỡnh tự 2 đoạn DNA kớch thƣớc 487bp (mồi IU-ID) và đoạn 559bp (mồi IU-ED)
b/ Xỏc định đột biến đảo đoạn intron 1 bằng phương phỏp Multiplex C
Cú 35/81 bệnh nhõn hemophilia A thể nặng bị đột biến đảo đoạn intron 22, 46/81 bệnh nhõn hemophilia A thể nặng cũn lại tiếp tục đƣợc sàng lọc đột biến đảo đoạn intron 1 theo phƣơng phỏp đƣợc mụ tả bởi Tizzano và cộng sự [99]. Kết quả 46 bệnh nhõn này khụng bị đột biến đảo đoạn intron 1.
Hỡnh 3.3. Hỡnh ảnh điện di sản phẩm PCR xỏc định đảo đoạn intron 1
Nhận xột:
Trong kết quả ở hỡnh 3.3, cỏc phản ứng multiplex PCR khuếch đại đoạn int1h1(P1) chỉ cho cỏc đoạn DNA kớch thƣớc 1908bp chứng tỏ cặp mồi 9F và 9cR thiết kế cho đoạn int1h1 bắt cặp với nhau. Cỏc phản ứng khuếch đại đoạn int1h2 (P2) đều cho kớch thƣớc 1191bp chứng tỏ chỉ cú cặp mồi int1h-2R và int1h-2F đặc hiệu cho đoạn int1h2 bắt cặp với nhau. Nhƣ vậy, khụng cú đột biến intron 1 ở cỏc bệnh nhõn mó số HA15, HA46, HA45 và HA24.
3.2.2.2. Kết quả phỏt hiện đột biến mất exon bằng phản ứng PCR:
Nghiờn cứu này cú 4 bệnh nhõn đột biến mất exon bao gồm HA38, HA51, HA55, HA64.
- Đột biến mất exon 8 và exon 9 ở bệnh nhõn HA64:
Hỡnh 3.4. K t quả PCR xỏc định đột bi n mất exon ở bệnh nhõn HA64
Nhận xột:
Bệnh nhõn mó số HA64 sau khi đƣợc khuếch đại toàn bộ 38 cặp mồi cựng với cỏc mẫu đối chứng õm và đối chứng dƣơng phỏt hiện ở vị trớ exon 8, exon 9 của bệnh nhõn khụng cú vạch DNA trong khi tất cả cỏc exon cũn lại đều lờn vạch DNA tƣơng ứng với mẫu đối chứng dƣơng. Điều này chứng tỏ bệnh nhõn bị đột biến mất đoạn exon 8 và exon 9.
- Đột biến mất exon 16 ở bệnh nhõn HA55:
Nhận xột:
Kết quả hỡnh 3.5 cho thấy ở bệnh nhõn HA55 cỏc mẫu chứng dƣơng đều lờn vạch DNA, mẫu đối chứng õm khụng cú vạch DNA, ở exon 15 và exon 17 của bệnh nhõn đều cú vạch DNA kớch thƣớc tƣơng ứng với mẫu chứng dƣơng trong khi ở exon 16 khụng cú vạch DNA chứng tỏ rằng bệnh nhõn HA55 đột biến mất exon 16 gõy bệnh hemophilia A.
3.2.2.3. Kết quả phỏt hiện đột biến bằng phương phỏp giải trỡnh tự
a/ Đột biến mất đoạn nucleotid
- Đột biến mất 15 nucleotid
Hỡnh 3.6. Hỡnh ảnh đột bi n mất đoạn 15 nucleotid ở bệnh nhõn HA46
Nhận xột
Bệnh nhõn mó số HA46 thể nặng, khụng phỏt hiện thấy đảo đoạn intron 22, intron 1. Khuếch đại 38 cặp mồi đều lờn vạch căng, rừ nột. Tinh sạch DNA của cỏc phản ứng khuếch đại này và giải trỡnh tự, sau đú so sỏnh với trỡnh tự ngƣời bỡnh thƣờng. Kết quả tại exon 4 phỏt hiện thấy đột biến mất 15 nucleotid tại vị trớ c.435-450. Khi kiểm tra sự thay đổi acid amin do đột biến gõy ra, thấy tại vị trớ protein từ 135 đến 139 bị mất 5 acid amin Tyrosin, Aspartic, Threonin, Valin, Valin (p.135-139delTyr- Val).
- Đột biến mất 3 nucleotid:
Hỡnh 3.7. Hỡnh ảnh đột bi n mất 3 nucleotid ở bệnh nhõn HA91
Nhận xột:
Bệnh nhõn HA91 khi giải trỡnh tự ở exon 14 phỏt hiện mất 3 nucleotid TCT. Khi kiểm tra trỡnh tự acid amin thấy cả ba nucleotid này mó húa trong một acid amin Phenylalanin. Do đú, đột biến chỉ làm mất acid amin này ở vị trớ p.1672, cỏc acid amin cũn lại vẫn mó húa bỡnh thƣờng (p.Phe1672del).
b/ Đột biến sai nghĩa:
Hỡnh 3.8. Hỡnh ảnh đột bi n ở bệnh nhõn mó s HA90 c.6545G>A
p.R2182H( Arg 2182 His ) c.6545
Người bỡnh thường Bệnh nhõn HA90
Nhận xột:
Hỡnh ảnh giải trỡnh tự ở bệnh nhõn mó số HA90 cho thấy: cú đột biến thay thế nucleotid G thành nucleotid A (G>A) trờn exon 23 của gen F8. So sỏnh với trỡnh tự Genebank thấy trờn exon 23 vị trớ c.6545 G>A, dẫn đến thay đổi acid amin vị trớ p.2182 của protein gen F8 từ Arginin thành Histidin (p.Arg2182His).
- Đột biến sai nghĩa: thay thế nucleotid T thành nucleotid C
Hỡnh 3.9. Hỡnh ảnh đột bi n của bệnh nhõn HA76
Nhận xột:
Ở bệnh nhõn HA76, tại exon 14 khi kiểm tra cú đột biến tại vị trớ c.5093 nucleotid T đƣợc thay thế bằng nucleotid C gõy ra đột biến thay thế acid amin Isoleucin bằng acid amin Threonin. Nhƣ vậy bệnh nhõn cú đột biến exon 14 của gen F8 tại vị trớ c. 5093T>C (p.Ile927Thr).
c/ Đột biến th m một nucleotid
- Đột biến thờm nucleotid C:
Hỡnh 3.10. Hỡnh ảnh đột bi n thờm nucleotid C của bệnh nhõn HA03
Nhận xột:
Hỡnh ảnh giải trỡnh tự cho thấy bệnh nhõn mó số HA03 cú đột biến thờm một nucleotid C trờn exon 14 của gen F8. Kiểm tra trờn trỡnh tự Genebank xỏc định thay đổi này trờn exon 14 là c.2777 insC, đột biến gõy lệch khung dịch mó toàn bộ acid amin cũn lại từ vị trớ p.927(p.Lys927ins).
- Thờm nucleotid A:
Hỡnh 3.11. Hỡnh ảnh đột bi n thờm nucleotid A của bệnh nhõn HA06
Nhận xột:
Bệnh nhõn mó số HA06 đƣợc giải trỡnh tự thấy cú đột biến thờm nucleotid A ở vị trớ c.4379. Đột biến này gõy dịch khung dịch mó toàn bộ acid amin cũn lại từ vị trớ p.1460 (p.Lys1460ins).
d/ Đột biến mất 1 nucleotid
- Đột biến mất nucleotid A
Nhận xột:
Hỡnh ảnh giải trỡnh tự cho thấy bệnh nhõn HA01 cú đột biến mất một nucleotid A trờn exon 14 của gen F8. So sỏnh với trỡnh tự Genebank thấy mất một nucleotid A tại vị c.3388, dẫn đến protein yếu tố VIII bị lệch khung dịch mó toàn bộ acid amin từ vị trớ p.1130 (p.Arg1130del).
- Đột biến mất nucleotid G:
Hỡnh 3.13. Hỡnh ảnh đột bi n mất nucleotid của bệnh nhõn HA39
Nhận xột:
Ở bệnh nhõn HA39, khi giải trỡnh tự toàn bộ 26 exon thấy tại vị trớ exon 14 cú đột biến mất nucleotid G tại vị trớ c.2185. Đột biến mất nucleotid G gõy lệch khung dịch mó làm thay đổi toàn bộ cỏc acid amin từ vị trớ p.729 (p.Ser729del).
e/ Đột biến vụ nghĩa
Hỡnh 3.14. Hỡnh ảnh đột bi n tạo stop codon của bệnh nhõn HA33
Nhận xột:
Bệnh nhõn mó số HA33 sau khi đƣợc giải trỡnh tự kiểm tra vị trớ đột biến cho thấy: đột biến thay thế nucleotid T bằng nucleotid A tại vị trớ 6425. So sỏnh với trỡnh tự Genebank cho thấy: đột biến này làm thay đổi acid amin Leucin tạo thành stop codon gõy dừng đột ngột quỏ trỡnh phiờn mó protein (p.Leu2142Stop).
f/ Đột biến tại vị trớ nối
Nhận xột:
Với những thay đổi bất thƣờng ở gần hoặc tại vị trớ đầu hoặc cuối exon là vị trớ nối giữa exon và intron, chỳng tụi sử dụng chƣơng trỡnh dự đoỏn vị trớ nối (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) để dự đoỏn những thay đổi ở RNA và kiểm tra xem đột biến đú đó đƣợc cụng bố chƣa. Do đột biến thay