PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

Sơ đồ nghiờn cứu

Cỏc kiểu hỡnh khỏc nhau trờn lõm sàng đƣợc chứng minh là do cỏc dạng đột biến khỏc nhau gõy nờn. Dựa vào đặc điểm này, chỳng tụi thiết kế mụ hỡnh xỏc định đột biến của cỏc thể hemophilia A nhƣ hỡnh 2.1:

- Đối với bệnh nhõn thể nặng, do đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm đa số nờn đầu tiờn cần tiến hành xỏc định hiện tƣợng đảo đoạn intron 22 bằng phƣơng phỏp inversion PCR. Khụng phỏt hiện đƣợc đột biến đảo đoạn intron 22 ta tiến hành tiếp trờn intron 1 bằng phƣơng phỏp multiplexPCR xem cú hiện tƣợng đột biến đảo đoạn intron 1 hay khụng. Nếu vẫn khụng xỏc định đƣợc thỡ ta khuếch đại toàn bộ 26 exon tỡm đột biến mất exon. Nếu cỏc exon đều lờn vạch tƣơng ứng kớch thƣớc DNA ngƣời bỡnh thƣờng thỡ phõn tớch đột biến điểm trờn 26 exon hoặc tại cỏc vị trớ nối bằng phƣơng phỏp giải trỡnh tự. Cỏc vị trớ đột biến xỏc định đƣợc sẽ xõy dựng bản đồ gen F8.

- Đối với những bệnh nhõn thể vừa và thể nhẹ do khụng bị đột biến đảo đoạn nờn chỉ sử dụng phƣơng phỏp PCR khuếch đại 26 exon tỡm đột biến, nếu khụng cú đột biến mất exon thỡ giải trỡnh tự gen trực tiếp để phỏt hiện cỏc dạng đột biến điểm. Cỏc vị trớ đột biến xỏc định đƣợc sẽ xõy dựng bản đồ gen F8.

2.3.1. Qu trỡnh lấ mẫu

Bệnh nhõn đó chẩn đoỏn hemophilia A đƣợc lấy 5 mL mỏu tĩnh mạch, cho vào ống chống đụng bằng EDTA với hàm lƣợng 1,5 mg/mL. Quy trỡnh lấy mỏu đảm bảo vụ trựng tuyệt đối.

2.3.2. Quy trỡnh tỏch chi t DNA từ mỏu ngoại vi

- Mỏu tƣơi chống đụng EDTA cần tỏch trong vũng 24 giờ.

- Cho 0,5 mL mỏu tƣơi toàn phần chống đụng bằng EDTA vào ống Eppendof 1,5 mL, thờm vào 0,5 mL dung dịch Lysis buffer rồi ủ trờn đỏ trong 10 phỳt.

- Ly tõm 8000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt ở 4oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn. quỏ trỡnh này đƣợc lặp lại 3 lần.

- Cho vào 0,5 mL dung dịch K, ly tõm 10 phỳt tốc độ 8000 vũng/ phỳt ở 4 oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn.

- Cho 0,5 mL Lysis buffer; 12,5 àL SDS 10%; 10 àL proteinase K, sau đú ủ 2h ở 56 o

C.

- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 oC, hồn hợp đƣợc chia làm 3 phần: lớp dung dịch phớa trờn cú chứa DNA, lớp ở giữa là cặn tế bào, lớp dƣới cựng là dịch chiết. Hỳt lấy phần dịch chứa DNA trờn cựng.

- Cho 0,5 mL chloroform: isoamyl, ly tõm mẫu ở 10.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 o

C, hỳt lấy phần dịch trờn cựng.

- Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thờm 50 àL sodium acetat, để lạnh ở -20 o

C trong 4 giờ.

- Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 20 phỳt ở 4 oC, đổ dịch nổi phớa trờn, thu tủa. - Rửa tủa bằng cồn 70 oC. Tủa DNA đƣợc hoà tan bằng 30 mL nƣớc tinh khiết. Phõn tử DNA thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng phỏp đo mật độ quang ở bƣớc súng 260/280 nm và điện di trờn gel agarose 0,8%.

+ Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thỡ DNA đƣợc coi là tinh sạch.

+ Chất lƣợng của DNA tốt khi điện di cho vạch rừ nột, băng gọn. Ngƣợc lại, phõn tử DNA bị đứt góy, lẫn nhiều protein hoặc cỏc tạp chất khỏc thỡ hỡnh ảnh điện di là một vệt trải dài khụng tạo thành băng gọn.

2.3.3. Qu trỡnh phỏt hiện đảo đoạn intron

2.3.3.1. Kỹ thuật Inversion – PCR xỏc định đột biến đảo đoạn intron 22 của gen F8

Phản ứng multiplex PCR với trỡnh tự ba mồi đƣợc thiết kế dựa vào trỡnh tự hệ gen ngƣời và vị trớ của enzym cắt BclI đó đƣợc chứng minh bằng phƣơng phỏp Southern Blot PCR.

Hỡnh 2.2. Vị trớ của enz m cắt BclI và cỏc mồi IU, ID, ED.

int22h2/3 ED

BclI BclI

Cỏc mồi IU, ID, ED đƣợc thiết kế cú chứa trỡnh tự enzym cắt giới hạn

BclI nằm ở hai đầu của int22h1 và một đầu của int22h2/3 (hỡnh 2.2).

Sau khi cắt sản phẩm DNA bằng enzyme cắt giới hạn BclI, 2 đầu DNA đƣợc nối lại bằng enzyme T4 ligate sẽ cho 2 sản phẩm DNA vũng cú kớch thƣớc 21,5 và 20 kb.

Hỡnh 2.3. Cỏc đoạn DNA đúng vũng sau khi n i bằng T4 ligate

Ở ngƣời bỡnh thƣờng, mồi IU bắt cặp với mồi ED tạo ra DNA đúng vũng kớch thƣớc là 21,5 kb; chứa đoạn int22h1 ở vựng BX842559 trờn Genebank, cú vị trớ của enzyme cắt giới hạn BclI: base 36204 trờn mồi IU và base 14595 trờn mồi ID (hỡnh 2.3.A). Khi khuếch đại bằng phản ứng multiplex PCR sẽ cho đoạn DNA cú kớch thƣớc 487 bp.

Khi hiện tƣợng đảo đoạn xảy ra, đoạn int22h1 nằm trong gen F8 đƣợc thay thế bằng đoạn int22h2 hoặc int22h3 nằm ngoài gen F8 cỏch đầu telomere 500kb, do đú DNA vũng cú kớch thƣớc là 20 kb (hỡnh 2.3.B). Lỳc này mồi IU sẽ bắt cặp với mồi ED (mồi ED đƣợc thiết kế nằm cạnh int22h2 và intron 22h3 cú chứa trỡnh tự enzym cắt giới hạn BclI). So sỏnh trỡnh tự mồi ED trờn Genbank ở vựng BX 276110 thấy vị trớ BclI trờn int22h3 là base 14703 và

DNA ngƣời bỡnh thƣờng

đúng vũng 21,5kb đoạn đúng vũng 20,0kb DNA bệnh nhõn đảo

int22h1 int22h2/3 IU 487 bp ID 460 27 BclI BclI IU 559 bp ED 460 99 BclI BclI B A

vựng BX 683327 cú vị trớ BclI trờn int22h2 là base 15265. Đột biến đảo đoạn sẽ khuyếch đại đoạn DNA cú kớch thƣớc 559 bp.

Sản phẩm sau khi khuếch đại đƣợc điện di trờn gel agarose 1,5% với marker 100bp và nhuộm bởi ethidium bromid để kiểm tra đột biến đảo đoạn. Quy trỡnh kỹ thuật gồm 3 bƣớc theo mụ tả của Rosetti và cộng sự [78]:

Bƣớc 1: Cắt DNA bằng enzym BclI: Thành phần phản ứng Thể tớch (l) Enzym BclI 1,2 Buffer BclI 10X 3,0 DNA 4,0 Nƣớc cất PCR 21,8 Tổng thể tớch 30,0 Ủ ở 500 C trong 4h. Tinh sạch sản phẩm cắt:

- Cho 0,2 mL Phenol: Chloroform: Isoamyl và 0,3 mL nƣớc tinh khiết vào 30L sản phẩm sau khi cắt. Trộn đều sau đú ly tõm 15000 vũng/phỳt trong 5 phỳt ở 4 oC. Hỳt lấy phần dịch chứa DNA trờn cựng.

- Cho 0,5 mL chloroform: isoamyl, ly tõm mẫu ở 10.000 vũng/phỳt trong 5 phỳt ở 4 o

C, hỳt lấy phần dịch trờn cựng.

- Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thờm 50 àL sodium acetat, ly tõm 15.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 oC, đổ dịch nổi phớa trờn và thu tủa.

- Rửa tủa bằng cồn 70 oC. Tủa DNA đƣợc hoà tan bằng 20 mL nƣớc tinh khiết. Phõn tử DNA thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng phỏp đo mật độ quang ở bƣớc súng 260/280 nm.

Bƣớc 2: Nối DNA bằng T4 ligate: Thành phần phản ứng Thể tớch (l) T4 ligate 3,0 Buffer T410X 4,0 DNA 20,0 Nƣớc cất PCR 13,0 Tổng thể tớch 40,0 Ủ ở 160 C trong 8h.

Tinh sạch sản phẩm sau nối: tƣơng tự nhƣ tinh sạch sản phẩm sau cắt.

Bƣớc 3: Khuếch đại DNA bằng phản ứng multiplex PCR

Thành phần phản ứng multiplex PCR Thành phần Thể tớch (l) Nƣớc cất PCR 11,3 Buffer 10X 2,0 dNTP (2,5 mM) 2,0 Mồi IU (10 pM) 0,5 Mồi ID (10 pM) 0,5 Mồi ED (10 pM) 0,5 Taq polymerase (5 u/l) 0,2 DNA 3,0 Tổng 20,0

Chu tr nh nhiệt của phản ứng multiplex PCR :

Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp

1 95oC - 10 phỳt

2 – 34 95oC - 50 giõy 58oC - 50 giõy 72oC - 2 phỳt

35 72oC - 10 phỳt

Bảo quản ở 10oC

Sản phẩm PCR khuếch đại đƣợc điện di kiểm tra đột biến đảo đoạn trờn gel agarose 1,5% với marker 100bp và nhuộm bởi ethidium bromid.

2.3.3.2. Kỹ thuật PCR xỏc định đột biến đảo đoạn intron 1 của gen F8

Theo quy trỡnh chuẩn của Tizzano và cộng sự [99]: DNA đƣợc khuếch đại bằng hai phản ứng multiplex-PCR cho 2 đoạn int1h1 và int1h2 với cỏc mồi tƣơng ứng: 9F, 9cR,int1h-2F và int1h 2F, int1h-2R, 9F (Hỡnh 2.4).

Hỡnh 2.4. Hỡnh ảnh vị trớ thi t k mồi đoạn intron1h1 và intron1h2

Ở ngƣời khụng cú đột biến đảo đoạn intron 1, trong phản ứng int1h1, mồi 9F và 9cR thiết kết đặc hiệu cho đoạn int1h1 nằm trong gen F8 bắt cặp với nhau khuếch đại 1 đoạn cú kớch thƣớc 1908 bp. Ở phản ứng int1h2, mồi

int1h-2F, int1h-2R thiết kế đặc hiệu cho đoạn int1h2 là bản sao tƣơng đồng của intron 1 nằm ngoài gen F8 bắt cặp với nhau khuếch đại 1 đoạn kớch thƣớc 1191bp (Hỡnh 2.4 A). Nếu đột biến đảo đoạn intron 1 xảy ra, int1h2 tỏi tổ hợp với int1h1 dẫn đến cỏc mồi sẽ cạnh tranh nhau trong phản ứng multiplex- PCR. Khi khuếch đại phản ứng int1h1 mồi int1h-2F bắt cặp với mồi 9cR cho đoạn DNA kớch thƣớc 1323 bp và ở phản ứng khuếch đại đoạn int1h2 mồi 9F vàint1h-2R bắt cặp với nhau cho đoạn DNA kớch thƣớc 1776bp (Hỡnh 2.4 B).

exon1

int1h2 exon2

exon1 exon2

A. Mồi bắt cặp trong trường hợp khụng đột biến B. Mồi bắt cặp trong trường hợp đột biến

int1h-2R int1h-2F 9F 9cR FVIII FVIII int1h-2R 9F int1h-2F 9cR A B 1191bp 1908bp 1776bp int1h1 1323bp

Thành phần của phản ứng:

Phản ứng 1: Khuếch đại đoạn int1h1

Thành phần Thể tớch (l) Nƣớc cất PCR 11,4 Buffer 10X 2,0 dNTP (2,5 mM) 2,0 Mồi 9cR (10 pM) 0,5 Mồi 9F (10 pM) 0,5 Mồi int1h-2F (10 pM) 0,5 Taq polymerase (5 u/l) 0,1 DNA 3,0 Tổng 20,0

Phản ứng 2: Khuếch đại đoạn int1h2

Thành phần Thể tớch (l) Nƣớc cất PCR 11,4 Buffer 10X 2,0 dNTP (2,5 mM) 2,0 Mồi int1h-2F (10 pM) 0,5 Mồi 9F (10 pM) 0,5 Mồi int1h-2R (10 pM) 0,5 Taq polymerase (5 u/l) 0,1 DNA 3,0 Tổng 20,0

Chu tr nh nhiệt của phản ứng Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp 1 95oC - 10 phỳt 2 – 34 95oC - 50 giõy 55oC - 50 giõy 72oC - 2 phỳt 35 72oC - 10 phỳt Bảo quản ở 10oC

Sản phẩm PCR khuếch đại đƣợc điện di kiểm tra đột biến đảo đoạn trờn gel agarose 1,5% với marker 1000bp và nhuộm bởi ethidium bromid.

2.3.4. Kĩ thuật PCR khu ch đại cỏc exon

Thành phần phản ứng C Thành phần Thể tớch (l) Nƣớc cất PCR 11,9 Buffer 10X 2,0 dNTP (2,5 mM) 2,0 Mồi xuụi 0,5 Mồi ngƣợc 0,5 Taq polymerase (5 u/l) 0,1 DNA 3,0 Tổng 20,0

Chu tr nh nhiệt phản ứng C như sau:

Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp

1 95oC - 10 phỳt

2 – 34 95oC - 50 giõy 55oC - 50 giõy 72oC - 2 phỳt

35 72oC - 10 phỳt

Bảo quản ở 10oC

Kiểm tra đột biến trờn gel agarose 1,5%. Nếu điện di trờn gel agarose khụng lờn vạch, nghi ngờ cú đột biến. Khuếch đại lại đoạn DNA đú với PCR ống chứng õm và chứng dƣơng để khẳng định đột biến. Nếu tất cả cỏc vạch DNA đều lờn vạch thỡ tinh sạch cỏc sản phẩm PCR để giải trỡnh tự.

2.3.5. Kỹ thuật điện di trờn gel agarose Cỏch chuẩn bị gel agarose 1,5% Cỏch chuẩn bị gel agarose 1,5%

- Cõn 1,5 g agarose hoà tan trong 10 mL boric acid EDTA (TBE). Sử dụng lũ vi súng để agarose tan, sau khi agarose tan hết để nguội 55-60o

C, đổ vào khuụn gel. Để bản gel đụng lại và ổn định hoàn toàn mới sử dụng.

- Gỡ lƣợc, đặt bản gel vào bể điện di chứa sẵn đệm TBE 10X sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.

- Pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA) Tris 0,89 M; acid boric 0,89 M; EDTA 2,02 M

Ti n hành kỹ thuật điện di

- Đƣa gel agarose vào mỏy điện di, cho TBE ngập gel.

- Dựng pipet và đầu cụn nhỏ hỳt lần lƣợt dung dịch ở mỗi ống đƣa vào giếng (5 àL/giếng).

- Sử dụng mỏy điện di 80-100V (Mupid- Nhật), điện di ở hiệu điện thế 100V khoảng 30 phỳt.

- Sau điện di, gel đƣợc ngõm vào ethidium bromide 10 phỳt, rửa qua nƣớc cất và đƣa vào soi dƣới đốn UV, chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng tử ngoại.

2.3.6. Giải trỡnh tự gen

2.3.6.1. Tinh sạch DNA (sử dụng Kit QIAGEN)

- Cho 500 àl dung dịch PB vào ống chứa 100 àl plasmid, lắc đều, để ở nhiệt độ phũng 30 phỳt.

- Hỳt hết dịch cho qua cột tinh sạch (do hóng Qiagen cung cấp). - Quay ly tõm 10000 v/p trong 30 giõy, đổ bỏ dịch ở đỏy ống. - Cho tiếp 750 àl PE vào cột.

- Ly tõm tiếp thờm 60 giõy để loại bỏ hết dịch trong cột. - Lấy cột ra, cho vào ống eppendorf 1,5 mL.

- Cho 50 àl dung dịch EB (gồm 10 mM Tris-Cl, pH 8,5).

- Để ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt, ly tõm 10000 v/p trong 60 giõy. - Dịch thu đƣợc ở đỏy ống là dịch chứa DNA đó đƣợc tinh sạch.

2.3.6.2. Quy trỡnh thực hiện giải trỡnh tự gen:

Thực hiện theo qui trỡnh và sử dụng phƣơng phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).

+ Giai đoạn 1: Chuẩn bị master mix cho phản ứng giải trỡnh tự gen

- Chuẩn bị effendorf 0,2ml đó đỏnh dấu sẵn thứ tự cỏc mẫu - Chuẩn bị húa chất để thực hiện phản ứng

- Làm tan hoàn toàn húa chất, trộn đều sau đú ly tõm nhẹ để toàn bộ dịch trờn nắp ống rơi xuống

- Tiến hành pha master mix theo bảng sau:

Thành phần Thể tớch (l)

Sản phẩm sau PCR đó đƣợc tinh sạch 1,0

Big Dye Buffer 5X 3,0

Big Dye terminator V3.1 (2,5X) 2,0

Nƣớc cất 13,0

Mồi đơn (5pmol/àl) 1,0

Tổng 20

Chỳ ý:

- Toàn bộ khõu chuẩn bị master mix phải đƣợc thực hiện trờn khay đỏ - Cỏc húa chất phải đƣợc làm tan và trộn đều trƣớc khi sử dụng

- Big dye 2,5X phải đƣợc bảo quản trỏnh ỏnh sỏng

- Mỗi DNA thực hiện hai phản ứng với mồi xuụi và mồi ngƣợc + Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng sequencing

- Sau khi chuẩn bị master mix cho phản ứng xong, ly tõm nhanh cỏc ống PCR để toàn bộ dịch dớnh trờn thành và nắp ống xuống dƣới và làm tan bọt.

- Xếp cỏc ống master mix vào mỏy PCR

- Chọn chƣơng trỡnh nhiệt đó đƣợc cài đặt sẵn trong mỏy theo chu trỡnh đó đƣợc tối ƣu húa.

- Kiểm tra lại toàn bộ chu trỡnh nhiệt:

Chu trỡnh Biến tớnh Bắt cặp Tổng hợp

1 96oC - 1 phỳt

2 – 26 96oC - 10 giõy 50oC - 5 giõy 60oC - 4 phỳt

Bảo quản ở 10oC

- Ấn nỳt “Start” cho mỏy bắt đầu chạy chƣơng trỡnh.

- Sau khi chạy xong chƣơng trỡnh đƣa mỏy về chế độ nghỉ và tắt mỏy - Lấy mẫu ra khỏi mỏy PCR

- Cỏc sản phẩm sau khi đƣợc khuếch đại bằng Big dye kit sẽ đƣợc tinh sạch bằng big Dye temination để loại bỏ toàn bộ big dye thừa và đem đọc trờn mỏy giải trỡnh tự gen ABI (Applied Biosystem)

- Cỏc nucleotid trờn gen sẽ đƣợc biểu hiện bằng cỏc đỉnh (peak) với 4 mầu tƣơng đƣơng với 4 loại nucleotid A,T,G,C

2.3.7. Phƣơng phỏp phõn tớch k t quả

So sỏnh trỡnh tự gen của bệnh nhõn với trỡnh tự gen chuẩn của Gen Bank (National center for biotechnology information, NCBI) NC_000023.11 bằng phần mềm CLC.

So sỏnh trỡnh tự cỏc acid amin của bệnh nhõn với trỡnh tự acid amin chuẩn của Genebank NP_000123.1 bằng phần mềm Blast của NCBI. Trong đú alanine là acid amin đầu tiờn của protein F8 trƣởng thành đƣợc đỏnh số 01. 19 acid amin trƣớc đú bắt đầu từ methionin bị loại bỏ trong quỏ trỡnh hoàn thiện protein F8 khụng đƣợc đỏnh số.

Khi phỏt hiện vị trớ nghi ngờ đột biến, tỡm cỏc vị trớ đột biến tƣơng ứng trờn cơ sở dữ liệu HAMSTeR và CDC. Nếu đột biến đó cụng bố thỡ khẳng định bệnh nhõn cú đột biến gõy bệnh. Trƣờng hợp đột biến ở bệnh nhõn chƣa thấy cụng bố thỡ phõn tớch tiếp khả năng gõy bệnh dựa trờn phần mềm cấu trỳc khụng gian 3D DNASTAR.

2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIấN CỨU

- Bệnh nhõn sẽ đƣợc thụng bỏo kết quả xỏc định vị trớ đột biến gen thụng qua bỏc sĩ điều trị.

- Bệnh nhõn cú trỏch nhiệm cung cấp đầy đủ cỏc thụng tin liờn quan đến tỡnh hỡnh bệnh tật của mỡnh.

- Cỏc xột nghiệm phõn tớch gen chỉ thực hiện khi cú sự đồng ý của bệnh nhõn.