CỦA VIỆT NAM
4.2.1. Tỷ lệ phỏt hiện đột bi n gen F8 ở bệnh nhõn hemophilia A
Tỉ lệ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến ớt nhất chiếm 2-7% tổng số bệnh nhõn hemophilia A [80], mặc dự đó đƣợc phõn tớch đột biến đảo đoạn intron, tất cả cỏc exon và vị trớ nối giữa intron/exon, giải trỡnh tự vựng promoter để kiểm tra đột biến. Tỷ lệ này cú thể thay đổi tựy theo tớnh chớnh xỏc của chẩn đoỏn bệnh hemophilia A và hiệu quả phỏt hiện đột biến của cỏc phƣơng phỏp sử dụng. Cỏc đột biến khụng phỏt hiện đƣợc cú thể nằm trong intron, một phƣơng phỏp xỏc định đột biến nằm sõu ở trong vựng intron là phõn tớch mRNA [44]. Tuy nhiờn, phõn tớch mRNA vẫn thất bại trong việc xỏc định đột biến trong một nhúm gồm 11 bệnh nhõn khụng tỡm thấy đột biến ở mức độ DNA mặc dự bệnh nhõn cú nồng độ FVIII thấp và cú biểu hiện triệu chứng chảy mỏu trờn lõm sàng [104].
Một trong những bệnh khú chẩn đoỏn phõn biệt là bệnh von Willebrand (vWD) type 2N với hemophilia A thể nhẹ. Do đú, một tỉ lệ đột biến khụng phỏt hiện đƣợc cú thể do chẩn đoỏn nhầm hai bệnh này [105]. Xột nghiệm ELISA dựa trờn nồng độ vWF-FVIII (vWF: FVIIIB) cú thể phõn biệt hai bệnh này nhƣng xột nghiệm này khụng phổ biến rộng rói. Yếu tố vWF liờn kết với FVIII cú tỏc dụng bảo vệ FVIII khỏi quỏ trỡnh phõn giải protein sớm. Cú hai vị trớ đột biến hay gặp: đột biến thứ nhất cú thể do một sự thay thế
nucleotid làm mất sự liờn kết vWF-FVIII. Hầu hết cỏc đột biến này nằm từ exon 17-27 của vWF. Đột biến thứ hai cũng cú thể ảnh hƣởng đến sự gắn kết của FVIII dẫn đến chỉ cú VWF đƣợc sản xuất mà khụng cú khả năng gắn kết FVIII, đột biến cú thể xuất hiện ở bất cứ vị trớ nào trong gen VWF. Cú một số trƣờng hợp, thiếu cả FV và thiếu FVIII (F5F8D) cũng biểu hiện nhƣ bệnh nhõn hemophilia A thể nhẹ cú nồng độ FVIII: 5-30 IU/dL do đột biến di truyền lặn trờn nhiễm sắc thể thƣờng cỏc gen LMAN1 hoặc MCFD2. Gen LMAN1 và MCFD2 kết hợp với nhau để vận chuyển FV và FVIII. Với những trƣờng hợp này cần xỏc định nồng độ FV cú thể loại trừ bệnh lý này [106].
Cỏc phƣơng phỏp phối hợp với giải trỡnh tự trực tiếp để xỏc định đột biến nhƣ phƣơng phỏp phõn tớch dị sợi kộp: Hai kỹ thuật thƣờng đƣợc sử dụng dựa trờn phõn tớch dị sợi kộp là phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tớnh (DHPLC: Denaturing high pressure liquid chromatography) và CSGE (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis) làm tăng khả năng phỏt hiện đột biến, hầu hết cỏc phũng thớ nghiệm cú tỷ lệ thành cụng từ 80 đến 95%. Cỏc kĩ thuật này đƣợc sử dụng để sàng lọc phỏt hiện những vị trớ đột biến, với bệnh nhõn khụng phỏt hiện đƣợc đột biến khi sử dụng phƣơng phỏp trờn thỡ sử dụng tiếp giải trỡnh tự gen trực tiếp. Tuy nhiờn, những phƣơng phỏp này rất nhạy cảm với điều kiện phũng thớ nghiệm. Do đú, tối ƣu húa cỏc điều kiện là một quỏ trỡnh khú khăn và tốn thời gian, kinh phớ nờn khụng phải phũng thớ nghiệm nào cũng triển khai thực hiện đƣợc.
Trong nghiờn cứu này, xỏc định đột biến trờn gen F8 đƣợc thực hiện trờn 103 bệnh nhõn đó đƣợc chẩn đoỏn hemophilia A khụng cú quan hệ huyết
thống cho thấy tỷ lệ phỏt hiện đột biến là 89,3%, cú 11 trƣờng hợp khụng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm tỉ lệ 10,7%. Tỉ lệ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến của chỳng tụi cao hơn cỏc tỏc giả khỏc cụng bố là 2-7%. Nguyờn nhõn cú thể do chỳng tụi chƣa thực hiện đƣợc phối hợp nhiều phƣơng phỏp khỏc để chẩn đoỏn cỏc vị trớ đột biến ở trong vựng intron, chƣa xỏc định đƣợc cỏc đột biến lặp đoạn DNA bằng phƣơng phỏp MLPA ... Tuy nhiờn, so với cỏc tỏc giả chỉ sử dụng phƣơng phỏp giải trỡnh tự để chẩn đoỏn thỡ tỉ lệ phỏt hiện bệnh của chỳng tụi cũng hoàn toàn phự hợp. Số bệnh nhõn phỏt hiện đƣợc đột biến trong nghiờn cứu này ở từng thể bệnh tƣơng ứng là: thể nặng 90,1%, thể trung bỡnh 86,7% và thể nhẹ là 85,7%. Tỉ lệ xỏc định đƣợc đột biến ở từng thể bệnh đƣợc tỏc giả Santacroce và cộng sự thực hiện trờn 1296 bệnh nhõn hemophilia A thực hiện ở Italia là 874 (89%), 146 (84%), và 133 (94%) tƣơng ứng với bệnh nhõn thể nặng, trung bỡnh và thể nhẹ [51]. Theo tỏc giả Bogdanova cũng chỉ sử dụng phƣơng phỏp giải trỡnh tự phỏt hiện đột biến cho kết quả xỏc định đƣợc đột biến ở từng thể là 100% thể nặng, 96% thể trung bỡnh và 88% thể nhẹ [35]. Tỉ lệ cỏc dạng đột biến khỏc nhau trong nghiờn cứu của chỳng tụi cho thấy hay gặp nhất là đảo đoạn intron 22 (38,1%), tiếp đến là dạng đột biến sai nghĩa 23,9%, đột biến mất /thờm nucleotid và đột biến vụ nghĩa cú cựng tỉ lệ 9,85%; đột biến vị trớ nối và đột biến mất đoạn lớn cú tỉ lệ là 4,4%.
4.2.2. Cỏc dạng đột bi n gõ bệnh hemophilia A ở Việt Nam
Để ỏp dụng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử ứng dụng trong chẩn đoỏn cỏc bệnh lý di truyền thỡ tỏch chiết DNA là khõu quan trọng nhất. Nếu cỏc phõn tử DNA đƣợc tỏch tốt, khụng đứt góy, khụng bị tạp nhiễm thỡ cỏc phản
ứng tiếp theo mới cú độ chớnh xỏc cao. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử
dụng phƣơng phỏp tỏch chiết DNA theo quy trỡnh phenol/chloroform. Theo
Adelli K, quy trỡnh phenol/chloroform mất nhiều thời gian và cụng sức, tuy nhiờn cỏc phõn tử DNA thu đƣợc cú độ tinh sạch và nồng độ DNA rất cao [107]. Để kiểm tra độ tinh sạch của 103 mẫu DNA bệnh nhõn, chỳng tụi tiến hành đo mật độ quang trờn mỏy phổ kế Nano-drop của Nhật Bản. Tỷ lệ mật độ quang của cỏc mẫu DNA đo ở bƣớc súng 260/280 nm luụn nằm trong khoảng 1,8-1,95 (Phụ lục 3) chứng tỏ cỏc mẫu DNA tỏch chiết cú độ tinh sạch cao đảm bảo chất lƣợng tốt cho cỏc kĩ thuật PCR tiếp theo. Nồng độ DNA thu đƣợc từ 480-1300 ng/ml đảm bảo thỏa món yờu cầu cần nồng độ DNA cao chuẩn bị cho kĩ thuật phỏt hiện đảo đoạn intron 22.
Dạng đột biến đảo đoạn intron 22 và intron 1 chỉ gặp ở cỏc trƣờng hợp hemophilia A chẩn đoỏn thể nặng trờn lõm sàng: những bệnh nhõn này cú biểu hiện khởi phỏt quỏ trỡnh chảy mỏu tự nhiờn, tỏi phỏt nhiều lần. Vị trớ chảy mỏu thƣờng là ở cơ, khớp. Xột nghiệm thấy hoạt tớnh FVIII < 1% [7].
a/ Xỏc định đột biến đảo đoạn intron 22
Gen quy định F8 đƣợc phỏt hiện và mụ tả từ những năm 1982 và 1984. Vào thời điểm đú đõy là gen lớn nhất đƣợc mụ tả. Gen F8 chứa 26 exon, cú chiều dài thay đổi từ 69 đến 3.106 bp. Trỡnh tự intron cú kớch thƣớc là 177,9 kb. Intron đƣợc loại bỏ trong quỏ trỡnh phiờn mó để tạo thành mRNA trƣởng thành cú chiều dài khoảng 9 kb và tổng hợp protein gồm 2332 acid amin. Cú nhiều intron kớch thƣớc lớn hơn 14kb nhƣ intron 1, 6,13, 14, 22, 25 trong đú intron 22 lớn nhất với kớch thƣớc là 32,8 kb [101].
Năm 1990, Levinson và cộng sự khi nghiờn cứu gen liờn quan đến một số bệnh rối loạn thần kinh trong khu vực q28 của NST X, cỏc tỏc giả xỏc định một đảo CpG trong intron lớn nhất của gen F8. Đảo CpG này nằm cỏch đoạn đầu gen F8 khoảng 1.8 kb phõn chia gen F8 thành gen A (F8A). Trong đú, gen F8A cú hƣớng phiờn mó ngƣợc chiều của gen F8 [107]. Sau đú, đến năm 1992 tỏc giả Freije đó chứng minh rằng nhiễm sắc thể X cú hai bản sao của gen F8A nằm ngoài gen F8, cỏch khoảng 500 kb gần đầu tận telomer [108].
Năm 1992, Levinson và cộng sự mụ tả một đoạn cú kớch thƣớc 2,5 kb gọi tờn là F8B, cú điểm xuất phỏt tại vị trớ đảo CpG nhƣ F8A. Tuy nhiờn cú hƣớng phiờn mó ngƣợc chiều với F8A, cựng một hƣớng nhƣ gen F8. Vị trớ bắt đầu của gen F8A và gen F8B nằm cỏch nhau 122 pb. Tại vị trớ đầu 5 'exon gen F8B của intron 22 cú khả năng mó húa cho tỏm acid amin và đƣợc nối với exon 23 đến exon 26 của gen F8.
Từ kết quả của cỏc nhà nghiờn cứu trƣớc, năm 1993 tỏc giả Lakich và cộng sự chỉ ra rằng intron 22 là intron lớn nhất trong gen F8. Intron 22 cũng chứa một đảo CpG, nằm ở khoảng 10 kb phớa đoạn dƣới của exon 22. Đảo CpG này xuất hiện nhƣ là một promoter hai chiều đối với cỏc gen F8A và F8B, cả hai đoạn gen này biểu hiện trong cỏc mụ khỏc nhau [31]. Năm 2001, gen F8A đƣợc biểu hiện mó húa cho protein huntingtin cú kớch thƣớc 40 kD, gọi là HAP40 [109] và đƣợc cho là liờn quan đến protein huntingtin trong bệnh Huntington. Chức năng của F8B khụng đƣợc biết. Vỡ khụng cú F8B tƣơng đƣơng trong hệ gen của chuột, những con chuột biến đổi gen biểu hiện gen F8B ngƣời bỡnh thƣờng dƣới sự kiểm soỏt của một promoter cytomegalovirus
đó đƣợc sử dụng để hiểu chức năng của nú. Điều đỏng ngạc nhiờn là những con chuột biến đổi gen F8B cho thấy: chậm phỏt triển, đầu nhỏ và khuyết tật ở mắt nghiờm trọng, do đú cần nhiều nghiờn cứu sõu hơn về protein này.
Năm 1993, hai nhúm nghiờn cứu trong đú một nhúm đƣợc dẫn đầu bởi Jane Gitschier tại Hoa Kỳ và một nhúm khỏc do Francesco Giannelli thực hiện tại Anh thực hiện quan sỏt một cỏch độc lập nhận thấy rằng: một nửa số bệnh nhõn Hemophilia A thể nặng khụng phỏt hiện thấy đột biến trong cỏc promoter, trỡnh tự gen mó húa gen F8 hay ở cỏc vị trớ nối giữa cỏc intron và exon [96], [109]. Tuy nhiờn, họ nhận thấy duy nhất một khiếm khuyết trờn mRNA ngăn cản sự khuếch đại nằm ở vựng ranh giới giữa exon 22 và 23. Sự bất thƣờng này nằm trong khu vực nội bộ của intron 22 và một mụ hỡnh xỏc định nguyờn nhõn đó đƣợc đề xuất dựa trờn sự tỏi tổ hợp giữa chuỗi F8A nằm ở intron 22 và hai bản sao tƣơng đồng nằm ngoài gen F8. Sự tỏi tổ hợp giữa cỏc bản sao tƣơng đồng đó dẫn đến hiện tƣợng đảo ngƣợc của DNA và tạo ra sự giỏn đoạn của gen F8.
Năm 1993, Lakich và cộng sự mụ tả phƣơng phỏp Southern blot dựa vào enzym cắt giới hạn BclI và sử dụng đầu dũ F8A để phỏt hiện sự thay đổi kớch thƣớc của hai trong ba đoạn DNA ở những bệnh nhõn bị đột biến đảo đoạn intron 22. Tỏc giả xỏc định tỉ lệ bệnh nhõn đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm khoảng 45% bệnh nhõn HA thể nặng [31]. Cả hai nhúm Hoa Kỳ và Anh phỏt hiện ra rằng đột biến này xảy ra với tỉ lệ khoảng 4 ì 10-6
trờn mỗi gen, mỗi giao tử, mỗi thế hệ.
Phƣơng phỏp Southern Blot đƣợc coi là tiờu chuẩn vàng và là phƣơng phỏp đầu tiờn cú thể phỏt hiện đƣợc đảo đoạn intron 22. Đõy là kỹ thuật cho kết quả chớnh xỏc, ngoài ra cũn cho phộp phỏt hiện tỡnh trạng mang gen bệnh nhƣ trong trƣờng hợp đƣợc mụ tả bởi Oldenburg [109]. Tuy nhiờn, kỹ thuật này đũi hỏi thực hiện từ 8-10 ngày mới cú kết quả. Ngoài ra, phƣơng phỏp này đũi hỏi sử dụng chất phúng xạ để đỏnh dấu ảnh hƣởng đến sức khỏe.
Từ sự bất cập của phƣơng phỏp Southern Blot, nhu cầu phỏt triển phƣơng phỏp khỏc đơn giản, nhanh chúng và ớt tốn kộm hơn để phỏt hiện đảo đoạn intron 22 là điều cần thiết. Liu và cộng sự đó thiết kế một xột nghiệm PCR đơn ống với cỏc đoạn DNA cú kớch thƣớc lớn (Long distance - PCR) để xỏc định đột biến đảo đoạn intron 22 ở bệnh nhõn hemophilia A thể nặng. Phƣơng phỏp mới đơn giản, nhanh chúng và tƣơng đối rẻ tiền và do đú trở thành phƣơng phỏp đƣợc lựa chọn trong nhiều phũng thớ nghiệm trờn toàn thế giới [77].
Tuy nhiờn phƣơng phỏp LD-PCR thực hiện khú khăn do khuếch đại cỏc đoạn DNA cú kớch thƣớc > 10 kb trong đú bao gồm một đoạn 3,3 kb với 79% là nucleotid C và G. Do đú phƣơng phỏp này phụ thuộc rất nhiều vào chất lƣợng DNA tỏch chiết, nhiệt độ gắn mồi và điều kiện thuốc thử . Với mục tiờu nõng cao hiệu quả xỏc định đột biến đảo đoạn intron 22, Bowen và cộng sự sử dụng phƣơng phỏp LD-PCR cải tiến gồm bốn phản ứng LD-PCR riờng biệt cho từng cặp mồi [110]. Sự tỏch biệt này cho phộp khuếch đại dễ dàng hơn cho mỗi cặp mồi.
Để khắc phục những vấn đề liờn quan đến khuếch đại trực tiếp của cỏc đoạn DNA cú kớch thƣớc rất dài, Rossetti đó thiết kế một phƣơng phỏp tiếp cận thay thế để xỏc định đảo đoạn intron 22 dựa trờn một biến thể xỏc định đột biến đảo đoạn cổ điển đƣợc thiết kế bởi Ochman cụng bố năm 1988. Phƣơng phỏp này cú ƣu điểm tiến hành nhanh chúng, kết quả thu đƣợc cú độ tin cậy cao, dễ thực hiện do sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại cỏc đoạn DNA cú kớch thƣớc ngắn (487 và 559 bp) [78].
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi thực hiện xỏc định đảo đoạn intron 22 bằng phƣơng phỏp Inversion - PCR. Cú 35 bệnh nhõn hemophilia A thể nặng đƣợc chẩn đoỏn đột biến đảo đoạn intron 22 trong tổng số 81 bệnh nhõn Hemophilia A thể nặng đƣợc sàng lọc chiếm tỉ lệ 43,7%. Tỉ lệ này tƣơng tự với tỉ lệ đột biến đảo đoạn intron 22 đƣợc cỏc tỏc giả cụng bố là 42-50% ở nhúm bệnh nhõn hemophilia A thể nặng [31], ở Đài Loan tỉ lệ này là 45,1% [111], 42,5 - 44,25% dõn số ở Ấn Độ [112] và 40-50% ở chõu Âu [110]
Đột biến đảo đoạn intron 22 vẫn là đột biến phổ biến trong bệnh hemophilia A thể nặng. Do đú, đõy vẫn là đột biến quan trọng cần kiểm tra đầu tiờn trong phõn tớch xỏc định đột biến ở bệnh nhõn hemophilia A.
b/ Xỏc định đột biến đảo đoạn intron 1
Cỏc nghiờn cứu trờn thế giới chứng minh tỉ lệ đột biến đảo đoạn intron 1 là1-5% [99], [113], [114]. Theo tỏc giả Naylor, tỉ lệ đột biến đảo đoạn intron 1 thấp hơn một phần mƣời đột biến đảo đoạn intron 22 phần lớn là do kớch thƣớc của bản sao int1h1 nhỏ hơn gần 10 lần so với int22h1 (1041 bp so với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9503 bp). Ngoài ra int1h1 chỉ cú một bản sao tỏi tổ hợp, trong khi int22h1 cú hai bản sao tỏi tổ hợp làm cho khả năng đột biến của int22h1 cao hơn int1h1. Sự giống nhau giữa cỏc bản sao của int1h1 là rất cao (99,9%) cũng là một lý do làm cho khả năng đột biến đảo đoạn ớt gặp hơn so với đột biến đảo đoạn int22h1 [115]. Trong nghiờn cứu này, 46 bệnh nhõn hemophilia A khụng bị đột biến đảo đoạn intron 22 trong tổng số 81 bệnh nhõn hemophilia A thể nặng đƣợc kiểm tra xỏc định đột biến đảo đoạn intron 1 bằng phƣơng phỏp multiplex PCR của tỏc giả Bagnal theo mụ tả ở mục 2.3.3.2 cho thấy khụng cú trƣờng hợp nào bị đột biến đảo đoạn intron 1. Chỳng tụi cho rằng kết quả õm tớnh này rất cú thể do mẫu nghiờn cứu của chỳng tụi chƣa đủ lớn để phỏt hiện dạng đột biến này. Trong nghiờn cứu của Andrikovics cũng cho thấy sự vắng mặt của đảo đoạn intron 1 khi nghiờn cứu 104 trƣờng hợp hemophilia A ở Hungary [116]. Ngoài ra, một nghiờn cứu gần đõy cho thấy tỷ lệ tổng thể của đảo đoạn intron 1 là thấp hơn 1% [28]. Đặc biệt, tỉ lệ này là khỏc nhau giữa cỏc chủng tộc. Nghiờn cứu trờn bệnh nhõn hemophilia A của Ấn Độ thấy tỉ lệ đột biến intron 1 là 2,7% [117], tƣơng tự nhƣ của nghiờn cứu ở Nam Phi [117]. Cỏc đột biến này chỉ xỏc định đƣợc ở những bệnh nhõn da đen mà khụng tỡm thấy đột biến đảo đoạn intron 1 trong số bệnh nhõn da trắng. Tuy nhiờn, đảo đoạn intron 1 là một đột biến quan trọng cần sàng lọc, mặc dự tỉ lệ xỏc định trong quần thể ngƣời da trắng thấp.
c/ Đột biến mất đoạn lớn
Sau khi thu đƣợc DNA cú chất lƣợng tốt, nghiờn cứu đó sử dụng kỹ thuật PCR với 38 cặp mồi đặc hiệu cho 26 exon của gen F8. Với kớch thƣớc lớn của