- ĐC: Môi trường cơ bản MS không bổ sung chất KTST.
a.Callus theo dõi sau 3 tuần nuôi cấy; b Callus theo dõi sau 8 tuần nuôi cấy;
cấy;
Thước 1 cm
3.2. NHÂN NHANH CALLUS
Chúng tôi tiến hành cấy mô callus thu được từ các thí nghiệm trên lên môi trường cơ bản MS có bổ sung phối hợp giữa 2,4-D (1,0-2,0 mg/l) và TDZ (0,1-0,3 mg/l) để xác định nồng độ chất KTST phối hợp tốt nhất cho nhân nhanh callus và đảm bảo cung cấp đủ nguồn callus sơ cấp cho các nghiên cứu tiếp theo [6]. Kết quả nghiên cứu sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phối hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng nhân nhanh callus Chất KTST (mg/l) Sinh trưởng callus 2,4-D TDZ KLT (g) 0,0 0,0 - 1,0 0,1 0,589e 1,0 0,2 3,406a
1,0 0,3 0,954d
2,0 0,1 0,684e
2,0 0,2 1,577c
2,0 0,3 2,597b
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan's test).
Theo bảng số liệu trên cho thấy, khi nhân nhanh callus trong môi trường cơ bản MS có bổ sung phối hợp giữa 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ, sau 8 tuần nuôi cấy cho kết quả cao nhất (KLT: 3,406 g), tiếp theo là nồng độ phối hợp 2,0 mg/l 2,4-D và 0,3 mg/l TDZ (KLT: 2,597 g). Tuy nhiên, callus được nhân nhanh trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ tăng trưởng tốt, có màu trắng đục, tơi xốp (Hình 3.4 a), nên phù hợp với nuôi cấy thu sinh khối callus.
Biểu đồ 3.5. So sánh ảnh hưởng của nồng độ phối hợp giữa 2,4-D và TDZ đến khả năng nhân nhanh callus
Đối với callus được nhân nhanh trên môi trường 2,0 mg/l 2,4-D và 0,3 mg/l TDZ, có sự tăng trưởng callus khá tốt, callus có màu trắng, ngã màu xanh nhạt, đặc hơn (Hình 3.4 b), xuất hiện những chấm màu tím nhạt trên cụm callus (Hình 3.4 c) và có dấu hiệu hình thành phôi soma sau 8 tuần nuôi cấy (Hình 3.4 d), nên callus trên môi trường này được chúng tôi quan tâm hơn khi nuôi cấy tạo phôi soma.
Hình 3.4. Callus nhân nhanh trên môi trường có sự phối hợp 2,4-D và TDZ
a. Callus trên môi trường phối hợp 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ.
b, c, d. Callus trên môi trường phối hợp 2,0 mg/l 2,4-D và 0,3 mg/l TDZ tương ứng sau 4, 6, 8 tuần nuôi cấy. tương ứng sau 4, 6, 8 tuần nuôi cấy.
3.3. TẠO PHÔI SOMA
Tạo phôi soma được sử dụng để vi nhân giống các loài cây thân cỏ, đặc biệt là các loài sâm quý trên thế giới. Đã có nhiều nghiên cứu về môi trường nuôi cấy vi nhân giống các loài sâm và đặc biệt là sự phát sinh phôi đã được nghiên cứu vào đầu những năm 1980 (Chang và Hsing, 1980; Tirajoh và cs, 1998; Choi và Soh, 1994, 1996; Shoyama và cs, 1997; Kevers và cs, 2000)
(dẫn theo Nhut và cs, 2012) [40]. Tuy nhiên, đến cuối năm 2011 vẫn chưa có công bố về sự phát sinh phôi ở cây sâm Ngọc Linh.
Nói chung, sự phát sinh phôi soma có thể xảy ra do đáp ứng với những biến đổi của các yếu tố ngoại sinh và nội sinh khác nhau mà trong đó bao gồm cả các chất điều hòa sinh trưởng. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Ngoài ra, nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này cũng rất quan trọng khi thăm dò các điều kiện nuôi cấy in vitro ở thực vật. Đối với sự phát sinh phôi, cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao [3, 18, 29, 36].
Mô callus (0,5×0,5 cm) được cấy lên môi trường bổ sung chất KTST để thăm dò khả năng tạo phôi soma, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm cảm ứng phôi soma trên các loại môi trường cơ bản MS, ½ MS, SH, White và sử dụng phối hợp các chất KTST 2,4-D, KIN và BA, NAA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả phôi soma chỉ hình thành trên môi trường cơ bản MS bổ sung phối hợp 2,4-D với KIN và môi trường SH bổ sung phối hợp BA với NAA.
3.3.1. Ảnh hưởng của phối hợp 2,4-D và KIN trong môi trường cơ bản MS đến khả năng tạo phôi soma từ callus MS đến khả năng tạo phôi soma từ callus
Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy tái sinh phôi từ callus trên môi trường bổ sung phối hợp nhiều cặp nồng độ giữa 2,4-D (1,0-3,0 mg/l) và KIN (0,1- 0,5 mg/l) trên môi trường cơ bản MS để thăm dò khả năng hình thành phôi soma, nhưng kết quả chỉ thu được ở các phối hợp giữa 2,0 mg/l 2,4-D với 0,1- 0,5 mg/l KIN là có ảnh hưởng đến khả năng hình thành phôi soma sau 8 tuần nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của phối hợp 2,4-D và KIN trong môi trường cơ bản MS đến khả năng tạo phôi soma từ callus
Chất KTST (mg/l) TLP (%) SLP (phôi/cụm) 2,4-D KIN 0,0 0,0 - - 2,0 0,1 3,84 2,29bc 2,0 0,2 26,00 6,84b 2,0 0,3 34,60 30,91a 2,0 0,5 0,00 0,00c - TLP: Tỷ lệ phôi hình thành (%).