1, 2, 3, 4, 5 Cây sâm Ngọc Linh có độ tuổi tương ứng: 3 tháng và 2, 3 ,5 năm tuổ
3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng
Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi,... Đối với một số loài thực vật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Để giải quyết những vấn đề này, người ta thường rửa mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc bề mặt của mô cấy với các chất khử trùng, tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng. Sau khi khử trùng, mẫu cấy được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3-5 lần [11, 12].
Hiện nay các hóa chất khử trùng thường được dùng phổ biến như: calcium hypochlorite, sodium hypochlorite, nước bromine, H2O2, HgCl2. Trong đó, HgCl2 được đánh giá là có hiệu quả diệt khuẩn khá và thường được sử dụng ở nồng độ 0,1%. Khi sử dụng ở nồng độ cao hơn 0,1 % thì dung dịch HgCl2 có tác dụng diệt khuẩn cao nhưng lại gây độc cho mẫu cấy và thường làm mẫu cấy chết hay không tái sinh [11, 41].
Xác định thời gian khử trùng mẫu cấy ban đầu để đánh giá khả năng khử trùng thích hợp cho tỉ lệ nhiễm và chết thấp nhất mà mẫu cấy vẫn có khả năng tăng trưởng và phát triển nhằm cung cấp đủ nguồn mẫu thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Mẫu cây sâm Ngọc Linh sau khi được thu thập, được đem rửa với xà phòng loãng 3 lần, sau đó rửa sạch dưới vòi nước chảy trong khoảng 2 giờ. Tiếp theo, mẫu được cắt với kích thước 5-6 cm để dễ dàng cho bước khử trùng mẫu. Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần trước khi chuyển mẫu
vào tủ cấy vô trùng. Trong tủ cấy, mẫu được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 45 giây và tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% từ 5-15 phút, sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng 5-7 lần trước khi cấy vào môi trường nuôi cấy ban đầu.
Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu cấy sau 4 tuần theo dõi, được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu cấy
Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) 5 87 43,68 0,00 56,32 7 116 11,21 1,72 87,07 9 105 8,57 13,33 78,10 12 96 3,13 29,16 67,71 15 94 0,00 43,62 56,38
Qua kết quả trình bày ở bảng 3.1 cho thấy, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian ngắn (5 phút) thì khả năng vô trùng mẫu thấp, tỷ lệ nhiễm mẫu cao (56,32%). Tuy nhiên, khi tăng thời gian khử trùng từ 5-15 phút, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần nhưng tỷ mẫu chết tăng. Trên biểu đồ 3.1. cho thấy, khử trùng mẫu trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt cao nhất (87,07%).
Biểu đồ 3.1. So sánh ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu
Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy của cây sâm Ngọc Linh đảm bảo vô trùng mà vẫn có khả năng tái sinh để tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm tiếp theo. Vì vậy, theo kết quả trên, chúng tôi chọn khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% tốt nhất là ở thời gian 7 phút.
3.1.2. Nuôi cấy ban đầu
Tế bào thực vật có khả năng phân chia từ bất cứ loại mô nào của cây để tái sinh các bộ phận hoặc trải qua các con đường phát triển khác nhau khi có điều kiện kích thích sinh trưởng phù hợp, tức là từ một loại mô cấy có thể tạo thành một dạng mô, cơ quan khác hay có thể tái sinh cây hoàn chỉnh dựa vào khả năng tạo hình và tính toàn năng của tế bào thực vật [41]. Để tạo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng đỉnh sinh trưởng, thân củ và cuống lá của cây sâm Ngọc linh 5 năm tuổi làm nguyên liệu nuôi cấy ban đầu.
Mẫu sau khi xử lý được cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có 8 g/l agar, 30 g/l sucrose và bổ sung chất KTST riêng lẻ 2,4-D (1,0-3,0 mg/l); kết hợp giữa 2,4-D (1,0-2,0 mg/l) và kinetin (0,1-0,3 mg/l); 2,4-D (1,0 mg/l) và TDZ (0,1-0,3 mg/l) để thăm dò các khả năng tái sinh của mẫu.
Theo dõi quá trình nuôi cấy ban đầu cho thấy, nồng độ các chất KTST đã có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo callus của mẫu cấy. Tất cả mẫu cấy đều không có sự tái sinh chồi trực tiếp kể cả mẫu cấy là đỉnh chồi, thay vào đó là sự hình thành callus trên các mẫu cấy lát mỏng thân củ và cuống lá. Nhưng thời gian và tỷ lệ hình thành callus trên hai loại mẫu này khác nhau không đáng kể.