T VN
2.2 VT LIU NGHIÊN CU
2.2.1 Ch ng vi sinh v t
25 ch ng Bacillus sp. (F0, F2, F5, F6, F11, F12, F13, F14, F21, F26, F27, F33, F34, F35, F36, Q16, Q111, Q270, BP76, BD68, BD33, T1, T3, T4, X122) đ c cung c p t phòng thí nghi m Công ngh vi sinh – Tr ng i H c M TP. H Chí Minh.
4 m u tômcó bi u hi n b nh ho i t gan t y c p tính t i đìa tôm thôn T Thi n, xã Ph c Vinh, t nh Ninh Thu n.
2.2.2 Tôm dùng đ th nghi m
Tôm gi ng kh e m nh đ c cung c p t tr i tôm gi ng Hoàng Thanh L ch 98B Chi L ng, ph ng 12, Tp. V ng Tàu, đ c nuôi trong b composit 1,5 m3 trong 45 ngày đ đ t kích th c trung bình kho ng 6 cm và tr ng l ng kho ng 1 g.
2.2.3 Môi tr ng - hóa ch t Agar Casein Cellobiose Citrat agar C n 70o, c n 90o D – xylose D u soi Galactose Glucose Gress A, Gress B Gi y th oxidase HCl 0,1N Kovac’s KH2PO4 Lugol TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar)
Manose Melibiose NaCl NaOH 0,1N Natri citrat NB (nutrient broth) Pepton Phenolred Rafinose
Safranin
Salicin
Thu c nhu m tím crystal violet
Thu c th catalase H2O2 5% Urea -naphtol 5% 2.2.4 Thi t b - d ng c Thi t b − Máy ly tâm − Máy vortex − Máy đo pH − Kính hi n vi − Máy l c − Cân đi n t − Máy đo OD − T c y − T m − T s y − N i h p vô trùng D ng c − a petri − Các lo i micropipette và đ u típ t ng ng (100-1000 µL, 20-200 µL) − Becher − Erlen − ng đong − ng nghi m
2.3 PH NG PHÁP NGHIÊN C U S đ 2.1 Ph ng pháp thí nghi m 2.3.1 Ho t hóa gi ng
T ng gi ch ng trong 20% glycerol, chúng tôi ti n hành c y ria trên đa môi tr ng NA, 37oC/ 24 gi .
Ch n nh ng khu n l c riêng l trên đ a môi tr ng NA, c y vào ng th ch nghiêng NA, 37oC/ 24 gi .
Gi các ch ng đã ho t hoá trên môi tr ng th ch nghiêng NA trong ng n mát t l nh, đ s d ng cho các th nghi m ti p theo.
2.3.2 Ph ng pháp thu nh n và phân l p vi khu n Vibrio
parahaemolyticus t m u tôm b nh
B n m u tôm đang m c b nh còn s ng đ c thu t i 4 ao nuôi thu c thôn T Thi n, xã Ph c Vinh, t nh Ninh Thu n. M u đ c c đnh trong n c 4oC và v n chuy n v PTN Công ngh vi sinh đ ti n hành phân l p vi khu n gây b nh.
Phân l p Vibrio paraheamolyticus t m u tôm b nh
Th nghi m LD50
Th đ i kháng v i m t s ch ng
Bacillus
Th nghi m tính an toàn c a ch ng
Bacillusđ c ch n lên tôm gi ng
ánh giá kh n ng b o v c a ch ng
Tr c khi phân l p vi khu n, kh trùng b m t ngoài c a tôm b ng c n 70o và lau s ch. Dùng pen tách b ph n giáp đ u ng c, l y m t ít gan t y tôm t ng sinh trong dung d ch peptone ki m, đem 24 gi 37oC. K đ n, dùng que c y ti t trùng l y m t ít m u gan t y đã đ c t ng sinh c y ria lên đa th ch môi tr ng Thiosunfate Citrate Bile Salt Agar (TCBS). a c y đ c 24 gi 37oC. Ch n khu n l c đi n hình (khu n l c màu xanh, hình nón, l i tròn) nuôi t ng sinh trong môi tr ng peptone ki m 24 gi 37oC. Ti n hành nhu m gram và đ nh danh s b b ng các th nghi m sinh hóa theo khóa phân lo i Bergey (Holt và cs., 1994).
2.3.2.1 Nhu m gram
Nguyên t c
S khác nhau gi a vách t bào Gram (+) và Gram (-) làm cho kh n ng b t màu màng t bào v i thu c nhu m khác. D a vào đ c đi m này ng i ta phân thành hai nhóm vi khu n. (Nguy n c L ng và cs., 2003)
Ti n hành
Các b c th c hi n nh sau:
− Nh gi t n c lên m t phi n kính s ch. T o huy n phù v i vi khu n c n nhu m, h nóng nh phi n kính cho đ n khô.
− Ph hoàn toàn v t bôi v i crystal violet. yên 1 - 2 phút r i nh nhàng r a trôi thu c nhu m d b ng n c.
− Nh dung d ch lugol trong kho ng 30 giây r i l i r a nh nhàng v i n c.
− T y c n 96o t 15 - 30 giây, sau đó r a n c. Ph hoàn toàn v t bôi v i safranin O và đ yên trong 1 phút. R a v i n c.
− Th m khô phi n kính v i gi y th m. Khi phi n kính khô hoàn toàn, quan sát d i kính hi n vi v i v t kính 100.
K t qu
T bào vi khu n Gram (+) b t màu tím. T bào vi khu n Gram (-) b t màu h ng.
2.3.2.2 Th nghi m oxidase
Nguyên t c
Các lo i vi khu n hi u khí tuy t đ i có enzym oxydase (cytochrom oxydase). Có th phát hi n oxydase b ng 2 cách. Môi tr ng NA ho c TSA, thu c th là gi m t y N – Dimethel – paraphenyldiamine hay dung d ch thu c tetra methyl – para phenylenediamine. (MacFaddin, 2000)
Ti n hành
Dùng que c y vòng l y vi khu n trong đ a vi khu n đã nuôi c y, ph t lên gi y t m thu c th . c k t qu trong vòng 30 giây – 1 phút.
K t qu
Ph n ng oxydase (+): que c y t m ho c gi t thu c th chuy n sang màu tím
đen.
Ph n ng oxydase (-): que c y v n gi màu tr ng đ c, ho c thu c th v n màu h ng.
2.3.2.3 Indol
Nguyên t c
Tryptophan là m t amino acid có th b chuy n hóa thành d ng ch y u: indol, skatole (methyl indol), indoleacetic acid (IAA) b i enzym tryptophanase t vi sinh v t. C u trúc pyrrole c a indole s k t h p v i para-Dimethylamino-Benzaldehyde (DMABA) trong thu c th Kovacs’ t o thành h p ch t quinone có màu tím đ . (MacFaddin, 2000)
Cách ti n hành
C y vi khu n vào môi tr ng NB, 37oC/ 24 gi . Nh 5 gi t thu c th Kovacs’ tr c ti p vào canh c y. L c nh và đ yên.
K t qu
ng (+): trong vài giây, l p ti p xúc gi a môi tr ng và thu c th chuy n sang đ .
ng (+/-): có màu cam trên b m t môi tr ng, đó là do skatole, là h p ch t b metyle hóa, có th là ti n ch t c a indol.
Trong tr ng h p ng (-) c n thêm 24 gi đ ki m tra l i.
2.3.2.4 Nitrat
Nguyên t c
M t s vi khu n có kh n ng s d ng ngu n nitrat làm ngu n hydro c ch t trong quá trình hô h p k khí, đ ng th i s d ng ngu n nitrat nh ngu n nit duy nh t, do kh n ng t ng h p enzym nitratreductase. Nitrat b kh thành nitrit r i có th b kh ti p thành NH3 ho c N2. (MacFaddin, 2000)
C ch ph n ng:
Acid sulfanilic không màu trong Gress A s k t h p v i nhóm NO2- t o thành mu i diazonium, acid sulfanilic b diazo hóa không màu ti p t c ph n ng v i - naphthylamine không màu t o thành h p ch t p-sulfobenzene-azo- -naphthylamine có màu đ . Tác nhân b i k m k t h p v i acid acetic trong thu c th s làm gi m l ng mu i diazonium do p-sulfobenzene-azo- -naphthylamine k t h p v i acid acetic, d i xúc tác c a b i k m t o ra arylhydrazine có màu.
Cách ti n hành
C y vi khu n vào môi tr ng th ch nitrat, 37oC/ 24 gi . Nh tr c ti p vào môi tr ng nuôi c y 2 gi t Gress A, 2 gi t Gress B.
K t qu
ng (+): có màu h ng đ .
ng (±): không đ i màu.
- M u th không đ i màu, có 2 tr ng h p x y ra:
Tr ng h p 1: NO3- không chuy n thành NO2-.
Tr ng h p 2: NO3- chuy n thành NO2- r i ti p t c chuy n thành NH3 hay N2.
- Ti p t c cho b t k m vào môi tr ng ph n ng:
ng (-): xu t hi n màu đ .
2.3.2.5 Citrat
Nguyên t c
M t s vi sinh v t có enzym citrat permease có kh n ng s d ng citrat trong môi tr ng có Na. Chúng gi i phóng ra môi tr ng ion Na+ khi s d ng citrat, làm pH môi tr ng gi m. ng th i nh ng vi sinh v t này c ng có kh n ng s d ng mu i amonium vô c NH4H2PO4 làm ngu n nit , gi i phóng NH3 ra môi tr ng làm ki m hóa môi tr ng, s thay đ i pH đ c nh n di n b ng ch th màu bromothymol blue có kho ng đ i pH t 6 – 7,6 t ng ng v i kho ng màu t vàng - xanh l c - xanh d ng. (MacFaddin, 2000)
Ti n hành
C y vi khu n vào môi tr ng th ch nghiêng Simmon’s Citrat 37oC/24 gi .
K t qu
ng (+): màu xanh d ng. ng (-): màu xanh l c.
2.3.2.6 Voges – Proskauer (VP)
Nguyên t c
Th nghi m Voges-Proskauer d a trên s phát hi n acetoin, là s n ph m bi n d ng cu i cùng t glucose.
Glucose th y phân thành s n ph m trung gian là acid pyruvic. T acid pyruvic, vi khu n s chuy n hóa ti p theo nhi u con đ ng khác nhau, trong đó m t s vi khu n s chuy n hóa ti p t c con đ ng t o thành acetoin, là ti n s n ph m c a 2,3- butanediol. (MacFaddin, 2000)
C ch ph n ng c a th nghi m VP (+):
- Glucose lên men t o acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC). - AMC + -naphtol , KOH và oxy không khí (l c) Diacetyl. - Diacetyl + nhân guanidine trong pepton t o màu h ng đ .
- Màu c a ph n ng xu t hi n sau 2-5 phút và đ m nh t sau 30 phút – 1h, và m t màu n u đ lâu h n n a.
- Th nghi m VP trên môi tr ng canh MR-VP, thu c th s d ng là -naphtol 5%, KOH 40%.
Cách ti n hành
C y vi khu n vào môi tr ng, 37oC/ 24 gi . Nh tr c ti p 0,6 mL -naphtol và 0,2 mL KOH, l c đ u trong 30 giây.
K t qu
Ph n ng VP (+): màu h ng đ trên b m t. Ph n ng VP (-): màu vàng c a thu c th .
2.3.2.7 Các th nghi m lên men đ ng
Nguyên t c
Vi khu n s d ng ngu n đ ng s chuy n hóa thành acid pyruvic làm pH môi tr ng gi m, quan sát s thay đ i pH c a môi tr ng d a vào ch th màu phenol red v i kho ng đ i màu 6,6 – 8 t ng ng t vàng – đ . (MacFaddin, 2000)
Ti n hành
C y vi khu n vào môi tr ng lên men đ ng c n kh o sát, 37oC/ 24 gi .
K t qu
ng (+): màu vàng.
ng (-): màu h ng đ n đ .
2.3.2.8 Th nghi m Methyl Red (MR)
Nguyên t c
M t s nhóm đ ng ru t nh E. coli, Salmonella,… chuy n hóa glucose thành acid pyruvic. R i ti p t c chuy n hóa acid pyruvic thành ethanol, acid acetic, acid lactic, acid succinic. Các acid t o ra làm pH môi tr ng gi m m nh, pH 4 – 4,5. pH này methyl red màu đ , ng c l i, pH cao h n thì Methyl red s chuy n sang màu vàng. (MacFaddin, 2000)
C y vi khu n vào môi tr ng NB, 37oC/ 24 gi , l y ra nh 5 – 10 gi t MR,
đ c k t qu .
K t qu
Ph n ng methyl red d ng tính: dung d ch methyl red trong môi tr ng v n gi nguyên màu đ . Ký hi u: MR (+).
Ph n ng methyl red âm tính: dung d ch methyl red trong môi tr ng chuy n t đ sang vàng. Ký hi u: MR (-).
2.3.2.9 Kh n ng phân gi i gelatin
Nguyên t c
M t s vi khu n có kh n ng t ng h p enzyme gelatinase ngo i bào th y phân gelatin thành polypeptide và axit amin làm phá h y đ c tính đông đ c c a gelatin ngay khi nhi t đ < 25oC và hóa l ng to > 25oC. (MacFaddin, 2000)
Ti n hành
Dùng que c y th ng c y vi khu n vào môi tr ng canh NB b sung 10% gelatin , 37oC/ 24 gi , th c hi n song song v i ng đ i ch ng không c y vi khu n.
K t qu
Sau khi l y ra cho vào ng n d i t l nh 30 phút – 1 gi . + N u môi tr ng hóa l ng ( + ).
+ N u môi tr ng đông đ c (-).
2.3.2.10 Xác đnh kh n ng di đ ng
Nguyên t c
C ch : m t s vi khu n có tiêm mao (flagella) nên có kh n ng di đ ng trong môi tr ng bán l ng và làm đ c môi tr ng hay m c gi ng nh r cây xung quanh đ ng c y.
Khi c n có th dùng mu i tetrazolium trong môi tr ng th di đ ng, tuy nhiên ch t này có tính c c ch vài lo i vi sinh v t. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) th ng đ c pha tr c v i n ng đ 1%, thanh trùng b ng màng l c vi khu n
0,45 m. Vi c b sung TTC giúp phát hi n di đ ng d dàng h n, đ c bi n nh ng tr ng h p khó đ c k t qu . (MacFaddin, 2000)
Ti n hành
- Dùng que c y th ng l y vi khu n trong ng c y sang ng nghi m th ch bán l ng, trích th ng t trên xu ng d i ngay gi a ng môi tr ng.
- Cho vào t m 37oC, trong 24 – 48 gi .
K t qu
- Ph n ng di đ ng d ng (+): Vi khu n m c lan ra kh i đ ng c y, xa hay g n tùy theo kh n ng di đ ng c a vi khu n m nh hay y u.
- Ph n ng di đ ng âm (-): vi khu n ch m c trên đ ng c y.
2.3.2.11 Kh n ng phát tri n NaCl 1 %, 6 %, 8 %
Nguyên t c
Th nghi m ch u đ ng mu i s d ng môi tr ng NB (Nutrient Broth), b sung NaCl đ t o ra môi tr ng có n ng đ mu i 1%, 6%, 8%. Môi tr ng này dùng đ
th nghi m kh n ng t n t i c a vi sinh v t trong môi tr ng có n ng đ mu i cao.
Vibrio parahaemolyticus có kh n ng phát tri n đi u ki n 1%, 6%, 8% NaCl,
do đó, th nghi m này góp ph n đ nh danh vi khu n. (MacFaddin, 2000)
Ti n hành
C y vi khu n v a đ c ho t hóa kho ng 18 – 24 gi vào môi tr ng NB b sung 1%, 6%, 8% NaCl, nuôi c y 37oC/24 gi . Kh n ng phát tri n th hi n qua kh n ng m c đ c, làm đ c môi tr ng nuôi c y.
2.3.3 Th nghi m kh o sát LD50
2.3.3.1 Chu n b tôm thí nghi m
Tôm s ch b nh và có kích th c đ ng đ u kho ng 1 g/ con, nuôi trong các b composit 1,5 m3 trong 45 ngày. N c nuôi đ c l c và thay 50 % n c tháng/ l n, th tích n c trong b là 700 L.
2.3.3.2 Ph ng pháp gây b nh th c nghi m
Vi khu n V. parahaemolyticus đ c ho t hóa môi tr ng TCBS 24 gi 37oC. Ch n khu n l c riêng l , c y t ng sinh trong môi tr ng canh peptone ki m (b sung 3 % NaCl), 24 gi 37oC.
Ph ng pháp th c hi n
H m c n c trong thùng x p xu ng còn 10 L. B sung d ch vi khu n vào thùng v i m t đ gây nhi m c n kh o sát. Sau 60 phút, b m n c vào l i đ đ t th tích ban đ u là 20 L (Capkin và cs., 2009).
B trí thí nghi m
Thí nghi m đ c ti n hành v i ch ng vi khu n gây b nh Vibrio
parahaemolyticus NT7 v i 5 nghi m th c, m i nghi m th c 3 l n l p l i, th tích
m i thùng là 20 L, b trí 30 con tôm có tr ng l ng kho ng 1 g. m i nghi m