Nguyên tắc: Đối với các mẫu hữu cơ trước hết phải được xay hay nghiền thành bột, vữa hay thể huyền phù. Sau đó dùng nhiệt để tro hóa mẫu, đốt cháy chất hữu cơ và đưa các kim loại về dạng oxyd hay muối của chúng. Cụ thể là: Cân lấy một lượng mẫu nhất định (5-10 gam) vào chén nung. Nung chất mẫu ở một nhiệt độ thích hợp, để đốt cháy hết các chất hữu cơ, và lấy bã vô cơ còn lại của mẫu là các oxit, các muối,…Sau đó hòa tan bã thu được này trong acid vô cơ, như HCl (1/1), HNO3 (1/2),…để chuyển các kim loại về dạng các ion trong dung dịch. Quyết định việc tro hóa ở đây là nhiệt độ nung và thời gian nung (nhiệt độ tro hóa và thời gian tro hóa) và các chất phụ gia thêm vào mẫu khi nung. Nhiệt độ tro hóa các chất hữu cơ thường được chọn thích hợp trong vùng
Tác giả Nguyễn Thị Thơm [33] trong khóa luận tốt nghiệp của mình cũng đã sử dụng phương pháp xử lý khô để xác định hàm lượng Cd trong đồ chơi nhựa bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS).
Tác giả Nguyễn Thị Châm [2] trong khóa luận tốt nghiệp của mình cũng đã sử dụng phương pháp xử lý khô để xác định hàm lượng Mn trong một số loại rau bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS).
Ưu – nhược điểm của kỹ thuật này là:
+ Tro hóa triệt để được mẫu, hết các chất hữu cơ,
+ Đơn giản, dễ thực hiện, quá trình xử lý không lâu như phương pháp ướt, + Không tốn nhiều axit tinh khiết cao và không có axit dư,
+ Hạn chế được sự nhiễm bẩn do dùng ít hóa chất, + Mẫu dung dịch thu được sẽ sạch và trong,
+ Nhưng hay bị mất một số nguyên tố như Cd, Pb, Zn,…nếu không dùng chất bảo vệ và chất chảy.
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu
Hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ thì vấn đề ô nhiễm đất, nước và không khí đang ngày càng nghiêm trọng, đặc biệt là ô nhiễm các kim loại nặng. Đối với nền Y học trong nước cũng như trên thế giới, thảo dược là nguồn nguyên liệu thuốc quý và cần thiết trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Thảo dược có thể bị nhiễm các chất độc hại từ môi trường, do đó ngoài việc nghiên cứu những hoạt tính sinh học đáng quý từ thảo dược, cũng cần phải kiểm tra hàm lượng của các chất có hại, ảnh hưởng đến chất lượng thuốc và có hại đến sức khỏe con người. Đặc biệt là
phải giám sát hàm lượng các kim loại nặng vì chỉ cần một lượng rất nhỏ của chúng cũng có thể gây ngộ độc cao đối với người sử dụng.
Chính vì vây, đối tượng và mục tiêu của luận văn này là nghiên cứu xác định kim loại nặng Pb, Cd trong thuốc đông y bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS).
2.1.2. Phƣơng pháp ứng dụng để nghiên cứu
Một số dược điển [38, 48] có đề cập việc kiểm tra kim loại nặng trong thuốc có nguồn gốc từ thảo dược nhưng chưa có đủ qui định cụ thể về giới hạn của các kim loại nặng cũng như phương pháp kiểm tra chúng. Phương pháp xác định giới hạn của các kim loại nặng cũng như phương pháp kiểm tra chúng. Phương pháp xác định giới hạn kim loại nặng đang được sử dụng là phương pháp so màu (phản ứng với Na2S hoặc thioacetamid) giữa dung dịch chế phẩm đã được xử lý so với dung dịch Pb đã biết chính xác nồng độ [28]. Khác với xác định Pb, xác định giới hạn kim loại nặng là xác định tổng số kim loại nặng qui về Pb (so sánh với mẫu chuẩn Pb), phương pháp này cho phản ứng với tất cả kim loại nặng nên không đặc hiệu đối với một nguyên tố kim loại. Độ nhạy của phương pháp ở mức ppm. Phương pháp này không thích hợp khi cho áp dụng cho các chế phẩm thuốc thảo dược do chúng thường chứa các chất có màu. Nếu vô cơ hóa (thường là nung) lượng nhỏ chế phẩm sẽ không đủ độ nhạy, còn vô cơ hóa lượng lớn rất khó thực hiện.
Theo phương pháp ngoài dược điển, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp xác định đặc hiệu đối với hầu hết các nguyên tố kim loại và giới hạn định lượng ở mức dưới ppm. Các tác giả ở viện kiểm nghiệm đã xây dựng phương pháp phân tích xác định Cu, Pb (2001), Asen (2003) trong các chế phẩm đông dược bằng AAS [13]. Do đó trong luận văn này chúng tôi chọn phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS)để định lượng Cd và Pb trong một số thuốc đông y.
tiến hành xử lý mẫu. Đối với phương pháp vô cơ hóa ướt, có thể xử lý hóa mẫu trong hệ hở ở điều kiện thường bằng cách sử dụng axit HNO3 65%, H2O2 30% đunvới mẫu đến khi khói màu nâu bốc lên và axit cạn. Cắn được hòa tan trong axit HNO3 2% và định mức đem đo phổ.
2.1.3. Các nội dung nghiên cứu
- Khảo sát chọn các điều kiện phù hợp để đo phổ GF-AAS của Cd và Pb.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến phép xác định Cd và Pb trong phép đo phổ GF-AAS.
- Khảo sát tìm khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn trong từng phép đo. - Đánh giá sai số và độ lặp lại của phương pháp.
- Đánh giá hiệu suất thu hồi.
- Ứng dụng phương pháp xác định Cd và Pb trong một số mẫu thuốc đông y theo phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn, so sánh GF-AAS với ICP-MS.
2.2. Giới thiệu về phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử [23, 42, 45] 2.2.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp AAS 2.2.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp AAS
Trong điều kiện thường, nguyên tử không thu cũng không phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ, lúc này nguyên tử ở trạng thái cơ bản. Nhưng khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu chúng ta kích thích nó bằng một chùm tia sáng đơn sắc có năng lượng phù hợp, có độ dài sóng trùng với các vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên tố đó thì chúng sẽ hấp thụ các tia sáng đó và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.
Trên cơ sở xuất hiện của phổ hấp thụ nguyên tử, chúng ta thấy phổ hấp thụ nguyên tử chỉ được sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và ở mức năng lượng cơ bản. Vì vậy, muốn thực hiện được phép đo phổ AAS cần phải thực hiện các công việc sau đây:
1. Chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn, dung dịch) thành trạng thái hơi. Đó là quá trình hóa hơi mẫu.
2. Nguyên tử hóa đám hơi đó, phân li các phân tử, tạo ra đám hơi nguyên tử tự do của các nguyên tố cần phân tích trong mẫu để chúng có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và quyết định đến kết quả của phép đo AAS.
3. Chọn nguồn phát tia sáng có bước sóng phù hợp với nguyên tố phân tích và chiếu vào đám hơi nguyên tử đó. Phổ hấp thụ sẽ xuất hiện.
4. Nhờ một hệ thống máy quang phổ, người ta thu toàn bộ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân li chúng thành phổ và chọn một vạch phổ cần đo của nguyên tố phân tích hướng vào khe đo để đo cường độ của nó. Trong một giới hạn nhất định của nồng độ, giá trị cường độ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của nguyên tố cần phân tích theo phương trình:
Aλ = k.C.L trong đó:
Aλ: Cường độ vạch phổ hấp thụ, k: Hằng số điều kiện thực nghiệm, L: Chiều dài môi trường hấp thụ (cm),
C: Nồng độ nguyên tố cần xác định trong mẫu đo phổ. 5. Thu và ghi lại kết quả đo cường độ vạch phổ hấp thụ.
2.2.2. Hệ thống, trang thiết bị của phép đo AAS
Dựa vào nguyên tắc của phép đo, hệ thống trang thiết bị của máy phổ hấp thụ nguyên tử gồm các phần sau:
Phần I: Nguồn phát chùm bức xạ đơn sắc của các nguyên tố cần phân tích
- Đèn catot rỗng (Hollow Cathode lamp HCL).
- Đèn phòng điện không điện cực (Electrodeless Discharge lamp- EDL). - Đèn phát phổ liên tục đã biến điệu (D2- lamp hay Xe-lamp)
Kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu bằng ngọn lửa đèn khí: kỹ thuật này ra đời đầu tiên cùng với sự ra đời của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS), nhưng kỹ thuật này có độ nhạy không cao, thường là trong vùng 0,05- 1ppm. Theo kỹ thuật này, người ta dùng năng lượng nhiệt ngọn lửa đèn khí để nguyên tử hóa mẫu. Do đó, mọi quá trình xảy ra trong ngọn lửa khi nguyên tử hóa mẫu đều phụ thuộc vào đặc tính của ngọn lửa [13]. Nhiệt độ ngọn lửa chính là yếu tố quyết định hiệu suất nguyên tử hóa mẫu phân tích. Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa: kỹ thuật này ra đời sau cùng với phép đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS), nhưng lại có độ nhạy rất cao đạt đến 0,1ppb và hiện nay đang được ứng dụng rất phổ biến. Trong kỹ thuật này, người ta dùng một lò nung bằng graphit (cuvet graphit) hay thuyền lantan để nguyên tử hóa mẫu. Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa là quá trình nguyên tử hóa mẫu tức khắc trong thời gian rất ngắn nhờ nguồn năng lượng của dòng điện có cường độ dòng rất cao (từ 50 đến 600A) và thế thấp (dưới 24V) trong môi trường khí trơ Ar. Quá trình nguyên tử hóa xảy ra theo các giai đoạn kế tiếp nhau: sấy khô, tro hóa luyện mẫu, nguyên tử hóa để đo phổ hấp thụ và cuối cùng là làm sạch cuvet. Trong đó hai giai đoạn đầu là chuẩn bị cho giai đoạn nguyên tử hóa đạt kết quả tốt. Ở giai đoạn nguyên tử hóa mẫu, dưới tác dụng của nguồn năng lượng, cuvet chứa mẫu phân tích sẽ được nung đỏ ngay tức khắc, mẫu sẽ được hóa hơi và nguyên tử hóa để tạo ra các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử. Kỹ thuật này có độ nhạy cao, gấp hàng trăm đến hàng nghìn lần phép đo trong ngọn lửa mà lượng mẫu tiêu tốn ít (mỗi lần 20-50μl). Do đó, không cần nhiều mẫu phân tích việc chuẩn bị mẫu cũng dễ dàng, không tốn nhiều hóa chất cũng như các dung môi tinh khiết cao đắt tiền.
Phần III: Hệ quang học và detector dùng để thu, phân ly toàn bộ phổ của mẫu và chọn vạch phổ hấp thụ cần đo hướng vào nhân quang điện để phát tín hiệu hấp thụ của vạch phổ.
Phần IV: Hệ thống chỉ thị kết quả đó có nhiều cách khác nhau, từ đơn giản đến phức tạp:
Các điện kế chỉ năng lượng hấp thụ của vạch phổ, các máy tự ghi lại cường độ vạch phổ dưới dạng các pic trên băng giấy.
Trang bị AAS hiện đại đầy đủ gồm: hệ thống bơm mẫu tự động (Auto Sampler), máy tính và phần mềm chuyên dụng điều khiển mọi quá trình làm việc của phép đo và xử lý, chỉ hiển thị kết quả đo ra màn hình.
-Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử đã và đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học bởi nó có nhiều tính năng ưu việt.
- Độ nhạy và độ chọn lọc cao.
- Không cần làm giàu nguyên tố cần xác định.
- Các thao tác thực hiện đơn giản, dễ làm, có thể xác định đồng thời hay liên tiếp nhiều nguyên tố trong một mẫu. Các kết quả phân tích ổn định, sai số nhỏ (sai số không quá 15% ở mức ppb)..
2.3. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.3.1. Hệ thống máy phổ 2.3.1. Hệ thống máy phổ
Để xác định lượng vết Pb, Cd bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS), chúng tôi sử dụng hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Model AA-6800 (hình 2.1). Đi kèm còn có bình khí Argon tinh khiết (99,99%), nguồn tạo tia đơn sắc là đèn catốt rỗng (HCL), Cuvet Graphit loại hoạt hóa toàn phần, hệ thống làm mát bằng nước, bộ lấy mẫu tự động, trang thiết bị phụ trợ khác.
Hình 2.1: Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử model AA-6800 của hãng Shimadzu
2.3.2. Hóa chất và dụng cụ 2.3.2.1. Hóa chất 2.3.2.1. Hóa chất
- Axit đặc HNO3 65%, HCl 36%, H2SO4 98%, H2O2 30% Merck, loại pA.
- Các dung dịch nền: (NH4)H2PO4 pA 10%, Pd(NO3)2 pA 10%, Mg(NO3)2 pA 10%, Ni(NO3)2..
- Dung dịch chuẩn Cd, Pb loại 1000ppm, Merck.
2.3.2.2. Dụng cụ
- Bình định mức 10, 25, 50, 100, 250, 1000 (ml)… - Pipet 1, 2, 5, 10 (ml)…
- Cốc thủy tinh chịu nhiệt 100ml, 250ml..
- Bình keldal dung tích 100ml, chén sứ, phễu lọc, đũa thủy tinh
2.4. Các cách tính toán và xử lý số liệu phân tích
- Độ lệch chuẩn
- Sai số và độ dao động - Độ lặp lại
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ) - Phương trình hồi quy
- Hiệu suất thu hồi
- So sánh từng cặp dùng chuẩn 2-t
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ
3.1. Khảo sát điều kiện đo phổ GF-AAS của Cd và Pb để xây dựng quy trình đo phổ 3.1.1. Khảo sát chọn vạch đo phổ 3.1.1. Khảo sát chọn vạch đo phổ
Mỗi nguyên tử của một nguyên tố hóa học chỉ có thể hấp thụ những bức xạ đặc trưng có bước sóng mà chính nó phát ra trong quá trình phát xạ. Thực tế không phải mỗi loại nguyên tố có thể hấp thụ được tất cả các bức xạ mà nó phát ra, quá trình hấp thụ chỉ tốt, nhạy chủ yếu với các vạch đặc trưng. Đối với một nguyên tố vạch phổ nào có khả
nguyên tố các vạch phổ khác nhau sẽ có độ nhạy khác nhau, đồng thời với mỗi vạch này có thể có rất nhiều các nguyên tố khác trong mẫu có những vạch phổ gần với vạch phổ này, nó có thể chen lấn hay gây nhiễu tới vạch phổ của nguyên tố phân tích làm cho việc đo cường độ vach phân tích là rất khó khăn và thiếu chính xác. Vì mục đích xác định hàm lượng Cd, Pb trong thuốc đông y thường có nồng độ rất nhỏ (lượng vết) nên chúng tôi tiến hành khảo sát để tìm ra vạch phổ có độ nhạy cao.
Đối với Cd: Chỉ có một vạch phổ nhạy là vạch 228,8nm. Vì vậy, chúng tôi chọn vạch
phổ 228,8nm để đo phổ hấp thụ của Cd. Chúng tôi tiến hành khảo sát với dung dịch Cd 1ppb trong nền HNO3 2% và kết quả chỉ ra ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khảo sát chọn vạch đo phổ của Cd
Vạch phổ (nm) Abs-lần 1 Abs-lần 2 Abs-lần 3 Abs-TB %RSD
228,8 0,1780 0,1782 0,1782 0,1781 0,07
Đối với Pb: Chỉ có một vạch phổ nhạy là vạch 217 nm. Vì vậy, chúng tôi chọn vạch
phổ 217nm để đo phổ hấp thụ của Pb. Khảo sát đối với dung dịch chuẩn Pb trong HNO3 2% và kết quả thu được ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khảo sát chọn vạch đo phổ của Pb
Vạch phổ (nm) Abs-lần 1 Abs-lần 2 Abs-lần 3 Abs-TB %RSD
217,0 0,2279 0,2340 0,2383 0,2334 0,52
283,3 0,0995 0,1153 0,1059 0,1069 0,79
Qua kết quả khảo sát ta thấy tại vạch đo 217,0 nm độ hấp thụ của Pb lớn hơn và sai số nhỏ hơn ở vạch đo 283,3 nm. Do đó, chúng tôi chọn vạch đo của Pb là 217,0 nm.
3.1.2. Khảo sát khe đo của máy phổ hấp thụ nguyên tử
Theo nguyên tắc hoạt động của hệ thống đơn sắc trong máy phổ hấp thụ nguyên tử, chùm tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố cần nghiên cứu được phát ra từ đèn catot
rỗng, sau khi đi qua môi trường hấp thụ, sẽ hướng vào khe đo của máy, được chuẩn trực, được phân ly và sau đó chỉ một vạch phổ cần đo được chọn và hướng vào khe đo để tác dụng vào nhân quang điện để phát hiện và xác định cường độ của vạch phổ. Do vậy khe đo của máy phải được chọn chính xác phù hợp với từng vạch phổ, có độ lặp lại cao trong