nhân giống lan Renanthera trên hệ thống ngập chìm tạm thời.
Mục đích: Xác định thể tích mơi trường nuơi cấy thích hợp cho việc tái sinh chồi từ PLB giống lan Renanthera trên hệ thống ngập chìm tạm thời.
Vật liệu: Các cụm PLB của giống Renanthera Red Number One được sử dụng cho thí nghiệm trong hệ thống ngập chìm tạm thời.
Mơi trường nuơi cấy: Mơi trường sử dụng là mơi trường khống cơ bản MS
cĩ bổ sung BA 1 mg/l, NAA 0,1 mg/l, nước dừa 10%, pepton 1 g/l và PVP 1 g/l, sucrose 25 g/l.
Phương pháp tiến hành: Cho 6 g PLB đã được nuơi cấy trên mơi trường thạch vào các bình Plantima cĩ thể tích mơi trường 150 ml, 200 ml, 250 ml và 300 ml. Sau đĩ cho hệ thống bơm hoạt động theo tần suất định sẵn là bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 3 phút, nghỉ 6 giờ.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 3 bình Plantima và được lập lại 3 lần
Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu được ghi nhận sau 3 tháng nuơi cấy bao gồm: - Khối lượng mẫu sống thu được (g) sau 2,5 - 3 tháng nuơi cấy.
- Số lượng chồi tạo thành sau nuơi cấy. - Số lượng PLB tạo thành sau nuơi cấy.
- Khối lượng mẫu chết (bao gồm các mẫu bị thủy tinh thể).
Xử lý số liệu: Số liệu thu được sẽ xử lý thống kê bằng chương trình MSTATC.
Hình 14. Lan Mokara Luenberger Gold Hình 15. Lan Mokara đỏ lá quặt
2.2 Nội dung 2. Triển khai nhân giống trên hệ thống TIS các giống lan Mokara, Renanthera và Phalaenopsis trên hệ thống ngập chìm tạm thời
Vật liệu:
Theo Phượng và cộng sự (2007), hệ số nhân giống trên hệ thống TIS hiệu quả ở giai đoạn nhân PLB và tái sinh chồi từ PLB nên giai đoạn tạo cây hồn chỉnh sẽ được chuyển qua nuơi cấy trên mơi trường thạch. Nguồn vật liệu chủ yếu lấy từ phịng thí nghiệm của Trung tâm. Riêng giống Phal. Amabilis lấy từ nguồn Viện sinh học Tây Nguyên và được kiểm tra sạch 02 loại virus ORSV và CyMV.
Để chuẩn bị cho cơng tác triển khai sản xuất thử, chúng tơi tiến hành nhân nhanh PLB các giống lan Mokara (M. Moon Light, Đỏ lá quặt, M. Christie Low), Renanthera (Ren. Red Number One, Ren Akihito), Phalaenopsis (Phal. Amabilis,
Phal. Jiuh Bao Sweetie) để tạo nguồn vật liệu ban đầu để đưa vào sản xuất thử trên
hệ thống ngập chìm tạm thời. Kết quả các chồi tái sinh đạt tiêu chuẩn sẽ được chuyển sang cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch; các PLB thu được sẽ tiếp tục tiến hành nuơi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời.
Mơi trường nuơi cấy: Dựa trên kết quả nghiên cứu của dự án ―Sưu tập nhập
nội và nhân nhanh các giống lan phục vụ thị trường nội tiêu và xuất khẩu 2006- 2010.
- Mơi trường nuơi cấy tái sinh chồi giống lan Mokara là mơi trường khống cơ bản MS cĩ bổ sung nước dừa 10%, pepton 1 g/l và PVP 1 g/l, sucrose 25 g/l.
- Mơi trường nuơi cấy tái sinh chồi giống lan Renanthera là mơi trường khống cơ bản MS cĩ bổ sung BA 1 mg/l , NAA 0,1 mg/l nước dừa 10%, pepton 1 g/l và PVP 1 g/l, sucrose 25 g/l.
- Mơi trường nuơi cấy tái sinh chồi giống lan Hồ điệp ( Phalaenopsis ) là mơi trường khống cơ bản MS cĩ bổ sung BA 1 mg/l , NAA 0,1 mg/l nước dừa 10%, pepton 1 g/l và PVP 1 g/l, sucrose 30g/l. Đây là mơi trường dựa trên nghiên cứu của Phượng và cộng sự (2007) nhưng cĩ bổ sung BA và NAA.
Phương pháp tiến hành:
Mỗi hệ thống ngập chìm tạm thời lắp tối đa là 40 bình Plantima. Khơng khí trước khi đưa vào bình plantima được đi qua hai bình chứa dung dịch CuSO4 (Bình 1 cĩ nồng độ Cu2+ 1 ppm và bình 2 cĩ nồng độ Cu2+ 0,7 ppm). Khơng khí sau khi qua 2 bình sẽ đi ra đường ống dẫn chính. Ở đây, khơng khí được lọc bởi filter lớn với kích thước lỗ lọc 0,4 µm trước khi đi vào filter 0,4 µm của từng bình Plantima. Mơi trường nuơi cấy các giống lan được cho vào các bình với thể tích phù hợp cho việc tái sinh chồi từ PLB các giống lan Mokara, Renanthera, Phalaenopsis. Các bình mơi trường này được hấp khử trùng ở điều kiện 1210
C trong vịng 25 phút. Mơi trường khi hấp khử trùng sẽ để trong phịng nuơi khoảng 1 tuần để kiểm tra nhiễm;
sau đĩ cho 6 g PLB hoặc 8g chồi (nhỏ) giống lan vào mỗi bình Plantima và tiến hành vận hành hệ thống ngập chìm tạm thời để sản xuất.
Điều kiện nuơi cấy:
Dựa trên nghiên cứu của Phương và cộng sự (2007), đối với các bình nhân giống lan Hồ điệp chạy trên một hệ thống với tần xuất 6 giờ bơm 1 lần và ngập 2 phút.
Đối với các giống lan Mokara và Renanthera dựa trên kết quả nghiên cứu của Trung tâm các bình trên 1 hệ thống chạy với tần xuất 6 giờ bơm 1 lần và ngập 3 phút.
Tất cả hệ thống nuơi cấy và mẫu cấy được duy trì trong phịng nuơi ở nhiệt độ 25 ± 20
C
Dự kiến sản phẩm đạt được: 200.000 cây lan cấy mơ các loại. Trong đĩ:
+ Năm 2009 và 2010: sẽ sản xuất được 100.000 cây bao gồm 20.000 cây lan Phalaenopsis (Hồ điệp), 50.000 cây Mokara, 30.000 cây Renanthera (Ren. Red).
+ Năm 2011 là 100.000 cây bao gồm 10.000 cây lan Phalaenopsis (Hồ điệp), 50.000 cây Mokara, 40.000 cây Renanthera (Ren. Red)
Chỉ tiêu theo dõi:
Đối với giống lan Mokara và Phalaenopsis sau 2,5 tháng nuơi cấy tiến hành theo dõi số liệu; đối với giống Ren. Red Number One sau 3 tháng nuơi cấy tiến hành lấy số liệu..
- Tỷ lệ nhiễm (%)
- Khối lượng mẫu sống thu được (g) sau 2,5 - 3 tháng nuơi cấy - Số lượng chồi tạo thành sau nuơi cấy
- Số lượng PLB tạo thành sau nuơi cấy hoặc khối lượng PLB và chồi nhỏ sau nuơi cấy.
- Khối lượng mẫu chết (bao gồm các mẫu bị thủy tinh thể).
Các đợt sản xuất thử trên hệ thống ngập chìm tạm thời như sau:
+ Sản xuất thử đợt 1: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 15/8/2009 và kết thúc ngày 30/11/2009. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 2: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 08/11/2009 và kết thúc ngày 08/02/2010. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 3: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 24/02/2010 và kết thúc ngày 24/05/2010. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 4: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 02/06/2010 và kết thúc ngày 01/09/2010. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 5: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 03/09/2010 và kết thúc ngày 04/12/2010. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 6: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 06/12/2010 và kết thúc ngày 08/03/2011. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 7: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 07/03/2011 và kết thúc ngày 07/06/2011. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 8: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 01/06/2011 và kết thúc ngày 01/09/2011. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
+ Sản xuất thử đợt 9: Thời gian bắt đầu triển khai nhân giống trên hệ thống TIS là 26/08/2011 và kết thúc ngày ngày 30/10/2011. Sau đĩ các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ được cấy tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường thạch.
Nuơi cấy tạo cây hồn chỉnh:
Sau 2,5 đến 3 tháng nuơi cấy trên hệ thống TIS các chồi lớn (cĩ 3 lá) sẽ được chuyển sang cấy trên mơi trường thạch để cung cấp cho các đơn vị theo đơn đặt hàng và các nhà vườn. Tiến hành theo dõi số cây thành phẩm.
Tiêu chuẩn cây thành phẩm:
TT Tên sản phẩm Đơn vị đo Cần đạt
1 2 3 4
2 Hồ điệp cây Cây cĩ ít nhất 3 lá, cĩ từ 2-3 rễ, cây sạch virus CyMV và ORSV, sinh trưởng tốt 3 Mokara cây Cây cĩ ít nhất 3 lá, cĩ từ 2-3 rễ, cây sạch
virus CyMV và ORSV, sinh trưởng tốt 4 Renanthera cây Cây cĩ ít nhất 3 lá, cĩ từ 2-3 rễ, cây sạch
CHƯƠNG III KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1. Nội dung 1. Hồn thiện quy trình nhân giống Mokara và Renanthera trên hệ thống ngập chìm tạm thời
3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thể tích nuơi cấy thích hợp để tái sinh chồi giống lan Mokara từ PLB.
Một số tác giả khi tái sinh thành cây con từ PLB chỉ cần sử dụng các mơi trường khống cĩ bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà khơng sử dụng chất điều hịa tăng trưởng.
Trong thí nghiệm này chúng tơi sử dụng 6g PLB ban đầu (tương đương 663 PLB) giống lan Mokara Luenger Gold đã kiểm tra khơng nhiễm 2 loại virus ORSV và CyMV cho vào mơi trường khống cơ bản MS cĩ bổ sung nước dừa 10%, pepton 1 g/l và PVP 1 g/l, sucrose 25 g/l nuơi cấy với 4 thể tích 150 ml, 200 ml, 250 ml và 300 ml khơng cĩ chất điều hịa sinh trưởng kết quả ghi nhận trong bảng sau:
Bảng 3.1. Khả năng tái sinh chồi từ PLB trên hê ̣ thớng nuơi cấy ngâ ̣p chìm tạm thời ở các thể tích 150 ml, 200 ml, 250 ml và 300ml
Nghiệm thức Khối lượng
mẫu sống /bình (g) Số lượng chồi/bình (chồi) Số lượng PLB/bình
Khối lượng mẫu chết/bình (g) STT V (ml) 1 2 3 4 150 200 250 300 38,6 ns 51,2 53,3 53,2 227 b** 479 a 359 ab 316 ab 1.464 b* 2.045 ab 2.711 a 2.557 a 3,8ns 2,4 2,4 4,7 CV % 12,5 17,4 18,7 32,8 Ghi chú: - CV%: Hệ số biến động
- ns: sai biệt giữa các nghiệm thức khơng cĩ ý nghĩa * sai biệt giữa các nghiệm thức cĩ ý nghĩa ở mức 0,05 ** sai biệt giữa các nghiệm thức cĩ ý nghĩa ở mức 0,01
Nhận xét:
- Khối lượng của mẫu sống: Khi sử dụng thể tích 200, 250 và 300 ml đều cao hơn hẳn so với khi dùng 150 ml. Tuy nhiên, qua phân tích thống kê khối lượng mẫu sống giữa các nghiệm thức khác biệt khơng cĩ ý nghĩa.
- Khả năng hình thành chồi: Kết quả khảo sát cho thấy sự hình thành chồi ở 4 thể tích khác biệt rất cĩ ý nghĩa. Và khi nuơi cấy PLB trên bình chứa thể tích mơi trường là 200 ml là cao nhất. Cụ thể với thể tích bình chứa 200 ml mơi trường, mẫu cấy phát triển xanh tốt đã tái sinh được 479 chồi cao hơn ở thể tích nuơi cấy 150 ml là 227 chồi, 250 ml là 359 chồi và 300 ml là 316 chồi. Kết quả nghiên cứu tái sinh chồi lan Hồ điệp lai (Phượng và cộng sự, 2007) trên 3 thể tích khác nhau là 150 ml, 200 ml và 250 ml cho thấy thể tích 200 ml là phù hợp nhất cho việc tái sinh chồi và
nhân chồi từ PLB với lượng mẫu ban đầu là 50 PLB cho một bình nuơi cấy. Khả năng tái sinh chồi từ PLB là yếu tố quan trọng của thí nghiệm này.
Nuơi cấy trên TIS ở thể tích 150 ml Nuơi cấy trên TIS ở thể tích 200 ml
Nuơi cấy trên TIS ở thể tích 250 ml Nuơi cấy trên TIS ở thể tích 300 ml
Cụm chồi khi nuơi cấy trên TIS
Hình 18. Tái sinh chồi từ PLB của giống lan Mokara
- Số lượng PLB: Ngồi việc tái sinh PLB thành chồi, các PLB tiếp tục được nhân lên trong mơi trường này và số lượng PLB được nhân lên cũng thay đổi theo
thể tích bình nuơi cấy. Số PLB ở các nghiệm thức 200 ml, 250 ml và 300 ml khác biệt cĩ ý nghĩa so với nghiệm thức 150 ml. Số PLB cao nhất là ở thể tích 250 ml (2711 PLB), kế đĩ là ở thể tích 300ml (2557 PLB), ở bình nuơi cĩ thể tích 200 ml chỉ tạo được 2045 PLB, và thấp nhất là ở bình cĩ thể tích 150 ml (1464 PLB). Khác với nghiên cứu tái sinh chồi của giống lan Hồ điệp lai (Phượng và cộng sự, 2007), 100% PLB (50 PLB đưa vào nuơi cấy) đều tái sinh chồi, tỷ lệ tái sinh chồi là 6,4% trên thể tích nuơi cấy 200 ml, khơng tạo PLB.
- Khối lượng mẫu chết: Qua theo dõi và phân tích thống kê cho thấy ở thể tích từ 150 ml đến 300 ml cho khối lượng mẫu chết khác biệt khơng cĩ ý nghĩa. Tuy nhiên về số học ở bình 150 ml khối lượng mẫu chết là 3,8 g, bình cĩ thể tích 300 ml cho khối lượng mẫu chết cao nhất (4,7 g) ở thể tích 200 và 250 ml cho thấy khối lượng mẫu chết ngang nhau.
Từ những số liệu ghi nhận được cho thấy khi tái sinh chồi từ PLB giống lan
Mokara Luenber Gold với thể tích 150 ml là khơng phù hợp, cĩ lẽ do ở thể tích này
khi bơm lên mẫu, quá trình cho ngập chìm lúc đầu cĩ thể đủ cung cấp cho lượng mẫu ban đầu bỏ vào, nhưng theo thời gian nuơi cấy lượng mẫu phát triển nhiều hơn mà dung dịch cĩ thể đã hao hụt ít nhiều nên khi bơm lên mơi trường khơng ngập mẫu, khơng đảm bảo việc cung cấp chất dinh dưỡng đồng đều cho mẫu cấy. Đồng thời lượng dinh dưỡng theo thời gian sẽ bị tiêu hao đi vì vậy mà khối lượng của mẫu sống thu được là thấp nhất và số lượng mẫu chết cũng cao.
Ở thể tích 300 ml cho số lượng chồi và số lượng PLB thấp hơn ở thể tích 250 ml. Điều này cĩ thể được giải thích là do lượng dung dịch nhiều trong bình nên khơng tạo được khoảng thời gian cho mẫu cĩ lúc khơ nên lúc nào mẫu cũng bị ẩm cao. Cĩ thể gây ra hiện tượng thủy tinh thể hoặc do lan Mokara là loại lan khơng chịu được ẩm độ cao trong quá trình nuơi cấy, nĩ địi hỏi phải cĩ giai đoạn khơ giữa 2 lần cho ngập, nên lượng mẫu chết ở thể tích này là cao nhất (4,7 g).
Ở 2 thể tích 200 và 250 ml cĩ thể đều phù hợp cho nuơi cấy Mokara, nhưng ở 200 ml cĩ thể là tốt nhất vì ở thể tích này cho khối lượng mẫu và số chồi cao nhất, lượng PLB cĩ thấp hơn ở 250 ml nhưng khơng đáng kể. Chúng tơi thấy ở thể tích này vừa cĩ hiệu quả kinh tế, vừa phù hợp cho quá trình nuơi cấy ngập chìm cần cĩ thời gian khơ mẫu giữa 2 lần bơm liên tiếp.
3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thể tích nuơi cấy thích hợp để tái sinh chồi giống lan Renanthera Red Number One từ PLBs
Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ PLB chỉ cần sử dụng các mơi trường khống cĩ bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà khơng sử dụng chất điều hịa tăng trưởng. Goh va Tan (1982) đã nghiên cứu tái sinh cây Renantanda
hybid trên mơi trường Vaccin – Went cĩ bổ sung đường 20 g.
Trong thí nghiệm này chúng tơi sử dụng 6g PLB ban đầu (tương đương 309 PLB) giống lan Renanthera (đã kiểm tra khơng bị nhiễm 02 loại virus ORSV và
CyMV) cho vào mơi trường khống cơ bản MS cĩ bổ sung BA 1 mg/l, NAA 0,1 mg/l, nước dừa 10%, pepton 1 g/l và PVP 1 g/l, sucrose 25 g/l nuơi cấy với 4 thể tích nuơi cấy 150ml, 200ml, 250 ml và 300ml, kết quả ghi nhận sau 3 tháng nuơi cấy trong bảng 3.2:
Bảng 3.2. Khả năng tái sinh chồi từ PLB trên hê ̣ thớng nuơi cấy ngâ ̣p chìm tạm thời ở các thể tích 150 ml, 200 ml, 250 ml và 300ml
Nghiệm thức Khối lượng
mẫu sống /bình (g) Số lượng chồi/bình (chồi) Số lượng PLB/bình
Khối lượng mẫu chết/bình (g)