Tất cả các hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự (1999):
Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy
Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ
Cung cấp sự hịa trộn đầy đủ
Hạn chế sự dịch chuyển
Cĩ thể thay đổi mơi trường và điều khiển tự động
Hạn chế sự nhiễm
Giá thành hạ
Tất cả các hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải cĩ khả năng tạo ra sự ngập chìm khơng liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều cĩ ngăn chứa mơi trường riêng, cĩ thể chung một bình chứa
nhưng cĩ hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylen thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuơi cấy thơng thường.
Tĩm lại, hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời thơng thường cĩ những bộ phận chủ yếu sau:
Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy mơi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại
Hệ thống timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập
Hệ thống ống dẫn và van điều khiển
Các màng lọc thống khí và loại bỏ vi sinh vât
Bình nuơi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh
Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuơi cấy khác nhau.
I.3.3.2 Một số hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời
Hệ thống tilting và hệ thống Rocker
Hai hệ thống này được thiết kế bởi Harris và Mason (1983). Hệ thống tilting thiết kế một số bình tam giác đặt nghiêng một gĩc 30 độ đối diện với nhau; cơng suất của máy này cĩ đặt khoảng 400 bình tam giác 50 ml hay 320 bình tam giác 125 ml. Hệ thống Rocker cĩ thể xoay 70 bình trụ trịn miệng rộng cĩ thể tích 910 ml trên các khay của hệ thống một gĩc 30 – 40 độ cứ sau mỗi 30 giây. Hai hệ thống này đều khơng cĩ hệ thống bổ sung mơi trường mới.
Hệ thống ngập chìm hồn tồn và cơ chế thay mới mơi trường dinh dưỡng
Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuơi cấy lớn cĩ thể nâng lên hạ xuống, mơi trường được bơm vào và rút ra khỏi buồng nuơi cấy theo chu kỳ nhất định trong điều kiện vơ trùng. Hệ thống nuơi cấy thực vật tự động (APCS, Hình 8) bao gồm hệ thống ống bằng silicone, hai bơm đẩy, hai bình thủy tinh chứa mơi trường, một van inox ba chiều bằng thép khơng gỉ, một buồng nuơi cây, và một bản điều khiển cĩ gắn các rờ le điện. Hệ thống này cĩ thể sử dụng để nuơi cấy thực vật trong một thời gian dài.
Hệ thống ngập chìm một phần và cơ chế thay mới mơi trường dinh dưỡng
Trong hệ thống này mơ thực vật luơn được đặt nằm trên phía trên giá đỡ (agar, màn propylene, cellulose). Mơi trường lỏng được bổ sung và rút khỏi bình nuơi cây. Chỉ cĩ phần dưới của mẫu cấy được tiếp xúc với mơi trường.
Hệ thống này cĩ 2 mơ hình Mơ hình Aitken – Christie và Jones (1987) và Aitken – Christie và Davies (1988) gồm một hệ thống bình chứa điều khiển bán tự động bằng polycarbonate cĩ kích thước 250 x 390 x 120 mm. (Hình 9A). Trong hệ
thống này, chồi Pinus spp. được nuơi trên mơi trường với giá thể agar với hệ thống bổ sung và rút mơi trường lỏng bằng hệ thống bơm theo một chu kỳ nhất định. Mơi trường lỏng từ nơi chứa tiếp xúc với mẫu cấy trong khoảng thời gian 4 đến 6 giờ bằng cách sử dụng máy hút chân khơng, sau đĩ mơi trường sẽ được rút cạn. Maene và Debergh (1985) đã chứng minh ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung mơi trường lỏng hay auxin vào mơi trường bán rắn ở giai đoạn cuối của nuơi cấy in vitro.
Mơ hình khác do Simonton và cộng sự năm 1991 thiết kế gồm hệ thống bơm điều khiển bằng vi tính cĩ thể bơm mơi trường lỏng vào bình nuơi cấy cĩ thể tích 7 lít theo chu kỳ (Hình 9B). Mẫu cấy được đặt trên một tấm lưới polypropylene gắn vào thành bình nuơi cấy. Hệ thống cĩ bộ phận điều khiển sự bơm mơi trường lỏng và điều tiết mức mơi trường trong những bình nuơi cấy, điều khiển vịng tuần hồn mơi trường theo lịch trình lập sẵn, thay đổi chương trình theo giai đoạn nuơi cấy và cĩ thể thay đổi được mơi trường.
Hệ thống ngập hồn tồn, trao đổi mơi trường lỏng bằng áp lực khơng khí và khơng cĩ chức năng thay mới mơi trường
Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mơ tả trong đĩ cĩ cả những hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và rất dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép tồn bộ mẫu cấy được tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng, đồng thời khơng khí trong bình nuơi được làm mới nhờ sử dung bộ phận bơm khí cĩ chức năng vừa cung cấp khơng khí vào mơi trường, vừa đẩy chất lỏng vào bình nuơi cây. Mẫu cấy được đặt trong bình nuơi thành một khối, điều này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ. Mơi trường lỏng được đẩy từ bình chứa mơi trường sang bình nuơi cây và ngược lại nhờ một áp lực khí bơm vào bình chứa chất lỏng. Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình cĩ cùng thể tích. Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với cơng tắt đã được lập trình. Điều này cho phép chúng ta xác định được thời gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây. Do những hệ thống này khơng cĩ bình chứa mơi trường mới
A
B
Hình 9.A: Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988), B: Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991)
nên mơi trường nuơi cấy phải được thay mới sau 4 – 6 tuần. Tuy nhiên việc thay đổi này rất nhanh và khơng cần thiết phải di chuyển mẫu cấy. Các biến thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đĩ là hệ thống RITA® (the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống bình đơi (BIT®) và hệ thống Plantima.
a. Hệ thống RITA®
Hệ thống RITA®
(Hình 10) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích 1 lít cĩ hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa mơi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào mơi trường lỏng ở ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong mơi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong thời gian mẫu ngập trong mơi trường lỏng, khơng khí được sục vào trong mơi trường lỏng dưới dạng những bọt khí gĩp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới khơng gian bên trong bình nuơi cây, áp suất vượt mức sẽ đẩy khơng khí trong bình ra ngồi qua một màng lọc khí trên nắp bình.
Hình 10. Hệ thống RITA®, Pha 1: mơ khơng ngập trong mơi trường, Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hĩa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy mơi trường lỏng lên ngập mơ cấy, Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA®, Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đĩng lại và mơi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới.
b. Hệ thống bình đơi BIT® Hệ thống bình đơi BIT® do Escalona và cộng sự (1998) thiết kế chủ yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do cĩ thể tích bình chứa lớn hơn và cĩ giá thành thấp hơn. Cách dễ dàng nhất để vận hành hệ thống nuơi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh cĩ dung tích từ 250 ml - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa mơi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Akita và Takayama (1994) đã đưa ra một hệ thống tương tự gọi là hệ thống nuơi cấy điều khiển mực chất lỏng bán liên tục để nuơi cấy tạo củ Khoai tây bi.
18
Hình 12: Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan.
Hình 12. Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan. Hình 11. Hệ thống BIT®
c. Hệ thống Plantima®
Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên cĩ thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các filter. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi cơng ty Atech, Đài Loan.
1.2.3.3 Ứng dụng hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống giống
Khi dự định sử dụng hệ thống nuơi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuơi cấy, chất lượng của mẫu cấy và so sánh giữa chúng với những mẫu được nuơi cấy trong hệ thống thơng thường.
+ Trong sự nhân nhanh chồi và các đoạn microcutting
Aitken – Christie và Jones (1987) chứng minh rằng khi nuơi cấy trong điều kiện cĩ sự ngập đầy mơi trường lỏng chồi cây Pinus radiata sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với trên mơi trường bán rắn. Hệ thống này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà khơng cần phải cấy chuyền mẫu cấy. Chồi thu được khi nuơi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và cĩ chất lượng tốt hơn so với những chồi thu được trên mơi trường bán rắn. Một chứng minh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhĩm AAH). Alvard và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng mơi trường lỏng tác động mạnh mẽ vào sự sinh trưởng và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân giống Chuối. Sự sinh trưởng của mẫu cấy theo 4 phương pháp nuơi cấy trong mơi trường lỏng khác nhau được so sánh với cách vi nhân giống thơng thường trên mơi trường thạch, sau 20 ngày nuơi cấy cĩ kết quả như sau:
Chồi Chuối trong mơi trường nuơi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose cĩ sự nhân chồi bình thường hay khơng cĩ gì khác biệt.
Chồi trên mơi trường bán rắn cĩ sự ngập một phần và trong mơi trường lỏng cĩ sục khí cĩ hệ số nhân chồi từ 2,2 – 3,1.
Hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuơi cấy trong điều kiện nuơi cấy ngập chìm tạm thời.
Các tác giả này đã thu được kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA®
với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhĩm nhà nghiên cứu Cuba đã thu được kết quả tương tự trên đối tượng cây Chuối Musa acuminata khi sử dụng hệ thống bình đơi (Teisson và cộng sự, 1999).
Hình 13. Hệ thống Plantima, a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập; b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima
Chồi cây Amelanchier x grandiflora Rehd. ‗Princess Diana‘ được nuơi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời được mơ tả bởi Simonton và cộng sự năm 1991 và so sánh với chồi nuơi cấy trên mơi trường bán rắn hay trong mơi trường lỏng của bình trụ trịn nhỏ và trên mơi trường bán rắn và mơi trường nuơi cấy lỏng khơng tuần hồn trong bình nuơi cấy 7 lít (Krueger và cộng sự, 1991). Thí nghiệm sử dụng mơi trường lỏng trong bình nuơi cấy 7 lít cĩ sự tiếp xúc với mơi trường lỏng theo chu kỳ cho hệ số nhân chồi là cao nhất so với các nghiệm thức khác. So sánh với quy trình thơng thường nuơi cấy trên mơi trường bán rắn trong những bình trụ trịn nhỏ), những mẫu cấy trong mơi trường cĩ sự tiếp xúc với mơi trường lỏng theo chu kỳ cĩ hệ số nhân chồi gấp 2,6 lần, trọng lượng chồi gấp 2,1 lần, chiều cao chồi gấp 1,2 lần.
Trên đối tượng cây mía Saccharum spp. Lorenzo và cộng sự (1998) đã chứng minh rằng hệ thống nuơi cấy ngập chìm dạng bình đơi đã đẩy mạnh một cách rõ rệt sự hình thành chồi và kéo dài chồi. Hệ số nhân (23,9 chồi trong 30 ngày) gấp 6 lần so với quy trình thơng thường (3,96 chồi trong 30 ngày; Jimenez và cộng sự, 1995). Kết quả tương tự cũng đã thu được trên ba giống Chuối khác nhau. Tương tự như vậy Escalona và cộng sự (1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuơi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy nuơi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khơ sau 42 ngày nuơi cấy. Hệ số nhân đã được gia tăng khoảng 300% so với nuơi cấy lỏng và 400% so với nuơi cấy trên mơi trường rắn. Cĩ gần 5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy
Đỉnh sinh trưởng của Potinera sp. (một lồi Lan), và Mitragyna inermis (Cow tree) được nuơi trong hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời APCS (Tisserat và Vandercook, 1985) phát triển nhanh hơn trên mơi trường rắn. Dựa trên việc tính trọng lượng tươi và thể tích, cho thấy các chỉ số này được gia tăng bốn lần sau 270 ngày nuơi cấy đối với lồi Lan trên và 1,8 lần sau 45 ngày đối với cây Mitragyna inermsi. Thí nghiệm tương tự được tiến hành trên đối tượng Callistephus hortensis, một lồi hoa Cúc, chồi của cây này khơng cho thấy sự khác biệt rõ ràng nào về sự sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro, nhưng khi ra ngồi vườn ươm, những chồi cĩ nguồn gốc từ nuơi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời sinh trưởng và phát triển mạnh hơn so với những cây trong hệ thống thơng thường.
Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng các microcutting trên mơi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân xấp xỉ 6 – 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989). Khi sử dụng hệ thống RITA® hệ số nhân tương tự cĩ thể được đạt tới chỉ trong vịng 5 – 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995). Ngồi ra sự gia tăng số lượng chồi cũng ghi nhận trên nhiều đối tượng khác như Nho Vitis vinifera L. (Harris và Stevenson, 1982; Harris và Mason, 1983), cây Arctostaphylos uva ursi
(L), Amelanchier alnifolia Nutt, cây Thuốc Lá Nicotiana tabacum ‗Xanthi-nc‘ và cây Fuchsia (Fuchsia hydrida ‗Swingtime‘) (Stevenson và Harris, 1980).
Đối với cây hoa African violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl), so sánh hiệu quả nhân chồi trên các hệ thống nuơi cấy khác nhau: Nuơi cấy trên thạch, nuơi cấy lỏng tĩnh, hệ thống bioreactor sục khí hình cầu, hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời kết quả cho thấy hệ thống ngập chìm tạm thời cho hệ số tăng sinh khối cao nhất: 23,17 lần so với hệ số nhân sinh khối của hệ thống nuơi cấy thạch truyền thống là 2,48 lần. Kết quả cũng cho thấy số lượng chồi trên cụm chồi, hệ số nhân
sinh khối ở hệ thống ngập chìm cao hơn hẳn so với hệ thống bioreactor sục khí hình cầu – mơt hệ thống bioreactor tiêu chuẩn cho hiệu quả nhân chồi cao ở nhiều đối tượng thực vật (Nhựt và cộng sự, 2010).
Nghiên cứu ―Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồ điệp Phalaenopsis‖, Phượng và cộng sự (2007) thực hiện thành cơng tại Trung tâm cơng nghệ Sinh học đã nghiên cứu và đưa ra kết luận sau:
Trong giai đoạn tái sinh chồi và nhân nhanh chồi, ở mật độ 50 PLBs, thể tích 200 ml, tần suất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ hệ thống này cho tỉ lệ nhân chồi gấp 3,7 lần so với nuơi cấy trên mơi trường thạch.
Ngồi ra, trong giai đoạn phát triển cây con, sử dụng 30 chồi nuơi trong bình Plantima cĩ thể tích mơi trường 250 ml và tần suất ngập là 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho thấy thời gian tạo cây con để cĩ thể đưa ra vườn ươm trên hệ thống này là 8 tuần so với 10 tuần trên mơi trường thạch. Ngồi ra tỉ lệ sống của cây con từ hệ thống TIS sau 1 tháng ở giai đoạn vườn ươm là 95%, trong khi tỉ lệ sống của các cây trên mơi trường thạch là 79%).