Ứng dụng hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống

giống

Khi dự định sử dụng hệ thống nuơi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuơi cấy, chất lượng của mẫu cấy và so sánh giữa chúng với những mẫu được nuơi cấy trong hệ thống thơng thường.

+ Trong sự nhân nhanh chồi và các đoạn microcutting

Aitken – Christie và Jones (1987) chứng minh rằng khi nuơi cấy trong điều kiện cĩ sự ngập đầy mơi trường lỏng chồi cây Pinus radiata sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với trên mơi trường bán rắn. Hệ thống này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà khơng cần phải cấy chuyền mẫu cấy. Chồi thu được khi nuơi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và cĩ chất lượng tốt hơn so với những chồi thu được trên mơi trường bán rắn. Một chứng minh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhĩm AAH). Alvard và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng mơi trường lỏng tác động mạnh mẽ vào sự sinh trưởng và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân giống Chuối. Sự sinh trưởng của mẫu cấy theo 4 phương pháp nuơi cấy trong mơi trường lỏng khác nhau được so sánh với cách vi nhân giống thơng thường trên mơi trường thạch, sau 20 ngày nuơi cấy cĩ kết quả như sau:

 Chồi Chuối trong mơi trường nuơi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose cĩ sự nhân chồi bình thường hay khơng cĩ gì khác biệt.

 Chồi trên mơi trường bán rắn cĩ sự ngập một phần và trong mơi trường lỏng cĩ sục khí cĩ hệ số nhân chồi từ 2,2 – 3,1.

 Hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuơi cấy trong điều kiện nuơi cấy ngập chìm tạm thời.

Các tác giả này đã thu được kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA®

với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhĩm nhà nghiên cứu Cuba đã thu được kết quả tương tự trên đối tượng cây Chuối Musa acuminata khi sử dụng hệ thống bình đơi (Teisson và cộng sự, 1999).

Hình 13. Hệ thống Plantima, a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập; b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima

Chồi cây Amelanchier x grandiflora Rehd. ‗Princess Diana‘ được nuơi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời được mơ tả bởi Simonton và cộng sự năm 1991 và so sánh với chồi nuơi cấy trên mơi trường bán rắn hay trong mơi trường lỏng của bình trụ trịn nhỏ và trên mơi trường bán rắn và mơi trường nuơi cấy lỏng khơng tuần hồn trong bình nuơi cấy 7 lít (Krueger và cộng sự, 1991). Thí nghiệm sử dụng mơi trường lỏng trong bình nuơi cấy 7 lít cĩ sự tiếp xúc với mơi trường lỏng theo chu kỳ cho hệ số nhân chồi là cao nhất so với các nghiệm thức khác. So sánh với quy trình thơng thường nuơi cấy trên mơi trường bán rắn trong những bình trụ trịn nhỏ), những mẫu cấy trong mơi trường cĩ sự tiếp xúc với mơi trường lỏng theo chu kỳ cĩ hệ số nhân chồi gấp 2,6 lần, trọng lượng chồi gấp 2,1 lần, chiều cao chồi gấp 1,2 lần.

Trên đối tượng cây mía Saccharum spp. Lorenzo và cộng sự (1998) đã chứng minh rằng hệ thống nuơi cấy ngập chìm dạng bình đơi đã đẩy mạnh một cách rõ rệt sự hình thành chồi và kéo dài chồi. Hệ số nhân (23,9 chồi trong 30 ngày) gấp 6 lần so với quy trình thơng thường (3,96 chồi trong 30 ngày; Jimenez và cộng sự, 1995). Kết quả tương tự cũng đã thu được trên ba giống Chuối khác nhau. Tương tự như vậy Escalona và cộng sự (1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuơi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy nuơi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khơ sau 42 ngày nuơi cấy. Hệ số nhân đã được gia tăng khoảng 300% so với nuơi cấy lỏng và 400% so với nuơi cấy trên mơi trường rắn. Cĩ gần 5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy

Đỉnh sinh trưởng của Potinera sp. (một lồi Lan), và Mitragyna inermis (Cow tree) được nuơi trong hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời APCS (Tisserat và Vandercook, 1985) phát triển nhanh hơn trên mơi trường rắn. Dựa trên việc tính trọng lượng tươi và thể tích, cho thấy các chỉ số này được gia tăng bốn lần sau 270 ngày nuơi cấy đối với lồi Lan trên và 1,8 lần sau 45 ngày đối với cây Mitragyna inermsi. Thí nghiệm tương tự được tiến hành trên đối tượng Callistephus hortensis, một lồi hoa Cúc, chồi của cây này khơng cho thấy sự khác biệt rõ ràng nào về sự sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro, nhưng khi ra ngồi vườn ươm, những chồi cĩ nguồn gốc từ nuơi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời sinh trưởng và phát triển mạnh hơn so với những cây trong hệ thống thơng thường.

Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng các microcutting trên mơi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân xấp xỉ 6 – 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989). Khi sử dụng hệ thống RITA® hệ số nhân tương tự cĩ thể được đạt tới chỉ trong vịng 5 – 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995). Ngồi ra sự gia tăng số lượng chồi cũng ghi nhận trên nhiều đối tượng khác như Nho Vitis vinifera L. (Harris và Stevenson, 1982; Harris và Mason, 1983), cây Arctostaphylos uva ursi

(L), Amelanchier alnifolia Nutt, cây Thuốc Lá Nicotiana tabacum ‗Xanthi-nc‘ và cây Fuchsia (Fuchsia hydrida ‗Swingtime‘) (Stevenson và Harris, 1980).

Đối với cây hoa African violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl), so sánh hiệu quả nhân chồi trên các hệ thống nuơi cấy khác nhau: Nuơi cấy trên thạch, nuơi cấy lỏng tĩnh, hệ thống bioreactor sục khí hình cầu, hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời kết quả cho thấy hệ thống ngập chìm tạm thời cho hệ số tăng sinh khối cao nhất: 23,17 lần so với hệ số nhân sinh khối của hệ thống nuơi cấy thạch truyền thống là 2,48 lần. Kết quả cũng cho thấy số lượng chồi trên cụm chồi, hệ số nhân

sinh khối ở hệ thống ngập chìm cao hơn hẳn so với hệ thống bioreactor sục khí hình cầu – mơt hệ thống bioreactor tiêu chuẩn cho hiệu quả nhân chồi cao ở nhiều đối tượng thực vật (Nhựt và cộng sự, 2010).

Nghiên cứu ―Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồ điệp Phalaenopsis‖, Phượng và cộng sự (2007) thực hiện thành cơng tại Trung tâm cơng nghệ Sinh học đã nghiên cứu và đưa ra kết luận sau:

 Trong giai đoạn tái sinh chồi và nhân nhanh chồi, ở mật độ 50 PLBs, thể tích 200 ml, tần suất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ hệ thống này cho tỉ lệ nhân chồi gấp 3,7 lần so với nuơi cấy trên mơi trường thạch.

 Ngồi ra, trong giai đoạn phát triển cây con, sử dụng 30 chồi nuơi trong bình Plantima cĩ thể tích mơi trường 250 ml và tần suất ngập là 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho thấy thời gian tạo cây con để cĩ thể đưa ra vườn ươm trên hệ thống này là 8 tuần so với 10 tuần trên mơi trường thạch. Ngồi ra tỉ lệ sống của cây con từ hệ thống TIS sau 1 tháng ở giai đoạn vườn ươm là 95%, trong khi tỉ lệ sống của các cây trên mơi trường thạch là 79%).

 Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện đề tài cĩ gặp phải khĩ khăn là tỷ lệ nhiễm cao (chiếm 30%). Do vậy sau khi đề tài kết thúc nhĩm tác giả tiếp tục tìm biện pháp khắc phục.

Ngồi ra nhĩm nghiên cứu của Phịng Thực vật – Trung tâm Cơng nghệ sinh học TP. HCM năm (2009) cũng ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống kiểng lá kết quả: Nhân chồi giống Lan Ý Mỹ trên hệ thống ngập chìm tạm thời kết quả cho thấy số lượng chồi tạo ra trong hệ thống ngập chìm tạm thời cao xấp xỉ 4 lần so với nuơi trong bình tam giác.

+ Trong sự tạo củ bi in vitro

Sự sinh trưởng và sự hình thành củ Khoai tây Solanum tuberosum L. được đẩy mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ thống bình đơi (Akita và Takayama, 1994). Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 – 960 củ sau 10 tuần nuơi cấy nhiều hơn những kết quả trong các cơng trình trước đĩ (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuơi cấy (Akita và Takayama, 1993). Trọng lượng tổng số và tính đồng nhất của củ cũng được gia tăng. Ngược lại trong điều kiện nuơi cấy ngập liên tục, khơng cĩ bất cứ sự hình thành củ nào. Teisson và Alvard (1999) đã kiểm chứng lại hiệu quả của nuơi cấy ngập chìm tạm thời lên sự tạo củ Khoai tây bằng cách tiến hành thí nghiệm trên hệ thống RITA® đơi dựa trên nguyên tắc hệ thống bình đơi. Ba củ bi được hình thành trên một đốt trong 10 tuần nuơi cấy. Năm mươi phần trăm củ cĩ trọng lượng lớn hơn 0,5 g. Hệ thống này rất cĩ hiệu quả và nhanh chĩng do cĩ từ 3 đến 4 chồi nảy lên từ một củ. Một số kết quả tương tự cũng thu được trên 3 giống Khoai tây khác (Teisson và Alvard, 1999).

+ Trong sự phát sinh phơi

- Gia tăng sự phát sinh phơi

Các hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời đã được chứng minh thành cơng hơn trong nuơi cấy phát sinh phơi khi được so sánh với các hệ thống thơng thường sử dụng mơi trường rắn hay nuơi cấy huyền phù trong bình tam giác. Tisserat và Vandercook (1985) thống kê sự sinh trưởng của phơi cây Cà-rốt và cây Chà Là

(Phoenix dactylifera) trong hệ thống APCS trong đĩ thời gian ngập chìm là 5 – 10

phút sau mỗi 2 giờ. So sánh với những cây nuơi cấy trên mơi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây Cà-rốt, và 4 lần đối với cây Chà Là trong hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời. Thêm vào đĩ chất lượng cũng như số lượng của phơi soma và cây con Cà-rốt được nâng lên. Tương tự một số giống Cà Phê cũng được thử nghiệm, sự phát sinh phơi trong hệ thống ngập chìm tạm thời hiệu quả hơn trong nuơi cấy lỏng lắc (Berthouly và cộng sự, 1995).

Đối với lan Hồ điệp, nhân nhanh PLB trong bình Plantima tối ưu ở mật độ 6g PLBs, thể tích 200 ml, tần suất ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ. Hệ số nhân PLBs trên thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời gấp 2,77 lần so với nhân trên mơi trường thạch và gấp 1,2 lần so với nuơi cấy lỏng lắc (Phượng, 2007).

Từ đầu năm 2008 đến nay, nhĩm nghiên cứu thuộc Trung tâm Cơng nghệ Sinh học đã tiếp tục tiến hành các khảo sát khả năng nhân PLB các nhĩm giống Mokara và Renanthera trên hệ thống ngập chìm tạm thời cho kết quả như sau:

 Đối với giống lan Mokara với các mật độ nuơi cấy 4g, 6g, 8g PLB với tần suất ngập chìm lần lượt là 3 phút sau mỗi 4 giờ, 3 phút sau mỗi 6 giờ và 3 phút sau mỗi 8 giờ và thể tích nuơi cấy 200 ml. Kết quả cho thấy mật độ nuơi cấy 6 g PLB và tần suất ngập chìm 3 phút sau mỗi 6 giờ cho kết quả tốt nhất so với các nghiệm thức

khác, mỗi hộp Plantima nuơi cấy tái sinh chồi cho 360 chồi và nhân PLB cho 8.200 PLB sau 10 tuần nuơi cấy. Nếu so với nuơi cấy trên mơi trường thạch, phương pháp nuơi cấy ngập chìm tạm thời cho phép nhân nhanh gấp 3 lần số chồi và gấp 5.1 lần số PLB.

 Đối với giống Renanthera: với các mật độ nuơi cấy 4g, 6g, 8g PLB với tần suất ngập chìm lần lượt là 3 phút sau mỗi 4 giờ, 3 phút sau mỗi 6 giờ và 3 phút sau mỗi 8 giờ và thể tích nuơi cấy 200 ml. Kết quả cho thấy mật độ nuơi cấy 6 g PLB và tần suất ngập chìm 3 phút sau mỗi 6 giờ, mỗi hộp Plantima nuơi cấy tái sinh chồi cho 300 chồi và nhân PLB cho 6.800 PLB sau 12 tuần nuơi cấy, nhân nhanh gấp 3 lần số chồi và gấp 4 lần số PLB so với mơi trường thạch.

- Sự phát triển phơi

Quy trình nhân và chất lượng của phơi soma trên nhiều đối tượng khác nhau đã được cải tiến bằng nuơi cấy ngập chìm tạm thời. Đối với cây Citrus deliciosa, Cabasson và cộng sự (1997) so sánh hiệu quả của những hệ thống nuơi cấy khác nhau lên sự phát triển của phơi soma. Phơi soma lấy từ nuơi cấy huyền phù được chuyển sang mơi trường bán rắn, sau đĩ cấy trở lại trong hệ thống nuơi cấy huyền phù hay nuơi cấy ngập chìm tạm thời. Khoảng 60% phơi soma nuơi cấy trên mơi trường bán rắn phát triển đến giai đoạn lá mầm nhưng chúng đều bị thủy tinh thể. Khi nuơi cấy tiếp trong hệ thống nuơi cấy huyền phù với tốc độ khuấy 100 vịng/phút, điều này đã cản trở sự hình thành lá mầm và tiền biểu bì và phơi soma khơng thể phát triển vượt quá giai đoạn phơi hình cầu. Hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời RITA®

cĩ khả năng đẩy mạnh sự phát triển của phơi soma, trong đĩ 66% phơi soma hình thành lá mầm và cĩ hình thái tương tự như phơi. Escalant và cộng sự (1994) tiến hành thí nghiệm trên một số lồi Chuối trong hệ thống RITA® sau 2 tháng, số lượng phơi soma được hình thành nhiều gấp 3 lần so với nuơi cấy trên mơi trường thạch (1375 so với 450 phơi). Nuơi cấy ngập chìm tạm thời gia tăng sự phát sinh phơi thứ cấp từ tế bào biểu bì của phơi sơ cấp. Sau 6 tháng từ số lượng ban đầu phơi soma nuơi cấy trong bioreactor thể tích 1 L đã tăng lên 40 lần xấp sỉ khoảng 6000 phơi. Ngược lại, sau hai tháng nuơi cấy trên mơi trường thạch các phơi chuyển sang dạng callus đặc màu trắng. Tỷ lệ chuyển đổi theo cách này cao tới 60 – 70% khi phơi soma cĩ nguồn gốc từ nuơi cấy ngập chìm tạm thời được chuyển sang mơi trường nuơi cấy bán rắn.

Đối với cây Cao Su Hevea brasiliensis sự hình thành phơi soma trên mơi trường cho kết quả rất thấp và số lượng cũng như chất lượng phơi soma khơng đáng kể (Etienne và cộng sự, 1997b). Sự tạo phơi soma trong nuơi cấy ngập chìm tạm thời gấp đến 4 lần so với nuơi cấy trên mơi trường bán rắn với hơn 400 phơi/g trọng lượng tươi của mẫu nuơi cấy phát sinh phơi. Nuơi cấy ngập chìm tạm thời cũng giúp giảm số lượng phơi bị bất thường cịn phân nửa cũng như giúp gia tăng tỷ lệ phơi phát triển lên tiếp. Hệ thống này cĩ thể giúp tỷ lệ nảy mầm của phơi lên tới trên 60%, tỷ lệ hình thành trụ trên lá mầm là 35%. Theo Teisson và cộng sự (1999) gần 150 phơi soma cây Cao Su ở giai đoạn cĩ lá mầm đã thu được trong một hệ thống RITA® từ tuần thứ tư đến tuần thứ tám sau khi bắt đầu chuyển giai đoạn phát sinh phơi vào trong hệ thống này. Tuy nhiên để tái sinh thành cây hồn chỉnh, những phơi nảy mầm cần được chuyển vào trong mơi trường bán rắn do khi cây phát triển thành phần ngọn và phần gốc, địi hỏi phải đặt cây con luơn đứng thẳng hướng lên

trên cùng hướng phát triển của cây. Trong hệ thống RITA® khơng thể đạt được yêu cầu trên vì cây luơn di chuyển mỗi khi mơi trường dâng lên ngập theo chu kỳ.

Đối với cây Cà Phê, ở lồi C. canephora sự tạo phơi soma với số lượng lớn cĩ thể được thực hiện trong các bình tam giác hay các bioreactor, trong đĩ cĩ thể đạt tới một vài ngàn phơi soma trong một gram dung dịch huyền phù (Berthouly và Etienne, 1999). Cây Cà Phê C. arabica là một lồi khĩ hơn. Để phổ biến trên quy mơ lớn lồi lai F1 của cây Cà Phê này ở Trung Mỹ, quy trình nhân giống đã thành cơng với xấp xỉ 20 dịng bằng cách sử dụng hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời RITA® (Etienne và cộng sự, 1997a). Tùy theo mỗi giống, cĩ thể thu được từ 15000 – 50000 phơi soma trong một gram dung dịch huyền phù tế bào, số lượng phơi soma hình thành khi sử dụng cĩ thể gấp đơi số phơi thu được khi nuơi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác. Chất lượng của phơi soma được hình thành trong hệ thống nuơi cấy ngập chìm tạm thời rất cao. Trong khi tỷ lệ phơi bình thường hình thủy lơi vào khoảng 30% khi nuơi cấy trong bình tam giác hay hệ thống bioreactor