Thí nghiệm 4 Nghiên cứu thủy phân đậu nành và gạo lứt bằng B.

B 12

2.2.1.4. Thí nghiệm 4 Nghiên cứu thủy phân đậu nành và gạo lứt bằng B.

bằng B.amyloliquefaciens (tỷ lệ vi khuẩn/cơ chất; điều kiện thủy phân: nhiệt độ, thời gian, chế độ khuấy trộn,…) thành các dạng protein và carbohydrat hòa tan, có vị ngon, không đắng và ít tạo đường khử

Nuôi lắc 36 – 48 giờ B.amyloliquefaciens trong môi trường sữa đậu nành + 1% đường.

Chọn các tỷ lệ dịch khuẩn: cơ chất (hỗn hợp đậu nành và gạo lứt được xay nhuyễn) 0,5%, 1%, 2% và 4% tương ứng với lượng sinh khối 0,52x109, 1,04x109, 2,08x109 và 4,16x109 (ĐVTKL/ml)

Xác định thời gian ngâm hạt cho trương nước, thời gian thủy phân cụ thể (qua đệm), có kết hợp khuấy trộn, nhiệt độ phòng bình thường.

Điều kiện ngừng thủy phân: cơ chất trở nên nhuyễn nhão song không bị đắng và có mùi thơm đặc trưng, không tạo bọt khí.

2.2.1.5. Thí nghiệm 5. Nghiên cứu dùng vi khuẩn lactic Lactobacillus

casei bảo quản cơ chất (đậu nành, gạo lứt) đã được thủy phân bằng B.amyloliquefaciens và được phối hợp với các nguyên liệu khác (nghệ, nấm mèo, gừng và bột sắn dây)

Chọn các tỷ lệ đường, giống Lactobacillus casei khác nhau để nghiên cứu bảo quản cơ chất bằng lên men lactic trong điều kiện nhiệt độ lạnh gia dụng và nhiệt độ phòng.

Bổ sung bột nghệ (1%) vô môi trường nuôi B.amyloliquefaciens (thạch + nước mắm) và môi trường nuôi Lactobacillus casei (thạch + cà chua + CaCO3) để khảo sát ảnh hưởng của nghệ đối với sự tăng trưởng của B.amyloliquefaciens và

Lactobacillus casei.

2.2.2. Nội dung 2. Phân tích các chỉ tiêu để thực hiện tiêu chuẩn hóa chất lƣợng của TUCN lƣợng của TUCN lƣợng của TUCN

2.2.2.1. Thí nghiệm 1. Nghiên cứu sinh tổng hợp vitamin B12 |9|

 vi khuẩn Propionibacterium sp. |17|

1 :

. .

cấy chuyền .  12 Propionibacterium sp. |9| 12 : 12 bằng Propionibacterium sp. 12 , lên men. (xem phần phụ lục 1)

. 300 . 300 10%. 12 g 4 Propionibacterium sp. 12 . Lên men Thu vitamin B12

Propionibacterium sp. 12 min B12 12 12 12 Propionibacterium sp. : - - 12 12 : từ 4 đến 8 . Propionibacterium sp. pH 4,5 – 7,5 nhưng vitamin B12 – 3 7.  Đị

Do trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.HCM thực hiện (xem phụ lục 7, phiếu xét nghiệm ngày 04/6/2011)

2.2.2.2. Thí nghiệm 2. Xác định tổng khả năng chống oxy hóa (Total

 Nguyên tắc

DPPH (1,1-diphenyl – 2 picrylhydrazyl) có dạng tinh thể màu tím tan trong methanol cho dung dịch có màu tím than. Về tính chất, DPPH là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong phân tử và có độ hấp thụ cực đại tại 517 nm.

Mục đích của phương pháp này là cho các dịch chiết có HTCOH tác dụng với gốc tự do DPPH với cơ chế làm mất màu DPPH. Sau một khoảng thời gian nhất định xác định được độ hấp thụ của hỗn hợp mẫu thử và độ hấp thụ của mẫu đối chiếu ở bước sóng 517 nm. Từ đó ta tính được khả năng đánh bắt gốc tự do của dịch chiết.

Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa (A_H) DPPH + A_H  DPPH_H + A

A + X  A_X  Chuẩn bị mẫu

DPPH: pha thành dạng stock 1 mg/ml, pha trong bình định mức 20 ml. Cân 0,02 g cho vào bình định mức 20 ml, thêm methanol (Merck) vào đủ 20 ml. Lắc đều cho tan hết. Bảo quản tránh ánh sáng ở 4oC.

Các mẫu đối chiếu:

- BHT: pha dạng stock 50 mg/ml chloroform pha trong eppendorf mới. Tránh ánh sáng, bảo quản ở 4oC.

- Vitamin C: pha dạng stock 50mg/ml methanol pha trong eppendorf mới. Tránh ánh sáng, bảo quản ở 4o

C.

Các mẫu thử nghiệm đã được chiết từ dung môi methanol sẽ được làm khô trước bằng phương pháp cô quay hoặc làm bay hơi ở 55 o

C.

Sau khi làm khô, cân lại các mẫu chiết, hòa lại vào dung môi tương ứng của từng mẫu sao cho có nồng độ 100mg/ml. Từ đó pha loãng thành các nồng độ thấp hơn (0,25 – 4 mg/ml) để phản ứng với DPPH và xác định giá trị EC50.

 Cách thực hiện

Đo các mẫu chiết có các nồng độ khác nhau (thể tích: 1ml dịch chiết + 0,25ml methanol) ở bước sóng 517 nm.

Cho 1ml DPPH 50 µg/ml tác dụng với 4ml dịch chiết mẫu có các nồng độ khác nhau sao cho nồng độ cuối cùng trong dịch là 10 µg/ml DPPH. Lắc đều, đem đo ở bước sóng 517 nm tại thời điểm 0 ,30, 60 phút.

Trước mỗi thời điểm đo phải chứng mẫu: 1ml DPPH + 4 ml dung môi chiết mẫu.

Vitamin C, BHT được sử dụng làm mẫu đối chiếu so sánh.  Đọc kết quả

Khả năng đánh bắt gốc tự do (S%) được tính theo công thức sau: S(%) = 100 (1 t) c t s A A At

s: Độ hấp thụ của mẫu thử ở thời điểm t = 30 phút, 60 phút At

c: Độ hấp thụ của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 30 phút, 60 phút

- Giá trị EC50 (mg dịch chiết khô/ml): là giá trị nồng độ của dịch chiết khô tác dụng với gốc tự do DPPH mà tại đó có hoạt tính chống oxy hóa là 50%. Giá trị EC50 càng thấp chứng tỏ khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ môi trường càng cao.

- Dựa vào kết quả hoạt tính chống oxy hóa ở các nồng độ khác nhau của mẫu thử, ta xây dựng phương trình hồi quy sau:

Hoạt tính chống oxy hóa (%) = a x nồng độ (mg/ml) + b

Dùng giá trị a và b trong phương trình hồi quy để tính giá trị EC50 EC50 =

a b

50

2.2.2.3. Thí nghiệm 3. Định lượng các thành phần dinh dưỡng

Định lượng 2 mẫu với thời gian bảo quản khác nhau: mẫu 0 giờ (mẫu sau khi phối trộn và rót chai) và mẫu đã bảo quản 3 tuần trong tủ lạnh gia dụng nhiệt độ 10 – 20oC.

 NTS, Nformol, NNH3, glucid, đường khử, lipid, peroxide

- NTS: định lượng theo phương pháp Micro Kjeldalh

bằng NaOH, từ đó gián tiếp xác định được lượng – NH2 (tiêu biểu cho chất đạm trong nguyên liệu).

- NNH3: Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm dưới dạng

vô cơ (muối amon hay các amin dễ bay hơi). Đây là loại đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình phân hủy carboxyl của acid amin) có bản chất là base, vì thế nếu dừng ở khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể. Nếu có sự hiện diện của nó ở hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là kém phẩm chất.

Do loại đạm này có tính kiềm yếu nên khi tác dụng với MgO thì những loại đạm trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, chúng sẽ bị lôi kéo theo hơi nước đến một bình chứa một lượng thừa acid. Sau đó đem định phân lượng acid dư cho phép ta xác định được loại đạm ammoniac này.

2(NH4)+ + Mg(OH)2  2NH3 + 2H2O + Mg2+ 2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4

- Glucid: định phân hàm lượng glucid dựa trên phản ứng màu đặc trưng

bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4

- Đường khử: trong môi trường kiềm, đường khử kali ferixianua thành

kali feroxianua. Với sự có mặt của gelatin, kali ferixianua kết hợp với sắt sulphate tạo thành một chất có màu xanh bền.

Cường độ màu được xác định trên máy so màu. Phương pháp này cho phép xác định lượng đường rất thấp trong dung dịch (0,01 – 0,1 mg/ml).

- Lipid: nguyên liệu được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên

liệu bằng ether dầu hỏa trên máy Soxhlet và xác định khối lượng chất béo.

- Peroxide: chỉ số peroxide là số gam iod giải phóng ra bởi peroxide có

trong 100g mẫu. Chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột.

 Định lượng 3 enzym (α amylase, protease, peroxydase) của sản phẩm và

của B.amyloliquefaciens:

- Phương pháp xác định hoạt tính enzym α-amylase

Hoạt tính enzym α-amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến

dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra,lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học.

- Phương pháp xác định hoạt tính enzym protease: Dùng protein casein

làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzym protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzym.

- Phương pháp xác định hoạt tính enzym peroxydase

Nguyên tắc

Xác định hàm lượng purpurogalin xuất hiện trong quá trình oxy hóa pyrogalol dưới tác dụng của peroxydase khi có H2O2. Đo lượng purpurogalin bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 430 nm.

Cách thực hiện

Hóa chất: dung dịch purpurogalin 0,2M, dung dịch H2SO4 0,1M, dung dịch H2SO4 5%, đệm veronal 0,1M pH 6,0, dung dịch purpurogalin 0,4 mg/ml.

Thang chuẩn có hàm lượng purpurogalin 0,4 mg/ml trong H2SO4 1% được pha như sau:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5

Purpurogalin (ml) 0 2 4 6 8

H2SO4 1%(ml) 10 8 6 4 2

Nồng độ purpurogalin (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Đo giá trị OD của các ống nghiệm. Tính ΔOD và dựng đồ thị chuẩn phản ánh tương quan giữa ΔOD và nồng độ của purpurogalin (mg/ml).

Lấy 1 g sản phẩm thức uống chức năng đậm đặc, thêm đệm veronal từ từ đến thể tích cuối cùng là 10 ml. Ly tâm 2000 vòng/phút trong 20 phút, lấy dịch trong để xác định hoạt độ enzym.

Cho vào ống nghiệm: 0,1ml dung dịch purpurogalin 0,2M, 10ml đệm veronal, 1,2ml nước cất, 0,5ml dung dịch H , 0,2ml dịch chiết enzym, ủ hỗn hợp phản ứng

ở 30oC trong 10 phút. Cho thêm 1ml dung dịch H2SO4 5% để ngừng phản ứng, đem đo mật độ quang học ở λ = 430 nm.

Tính kết quả

Hoạt độ enzym được tính theo giá trị ΔOD giữa ống thử thật và ống thử không, xác định với lượng purpurogalin từ đồ thị chuẩn.

Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym trong 10 phút xúc tác để tạo thành 1µmol purpurogalin.

 Xác định khả năng tạo kháng sinh của B.amyloliquefaciens

Đĩa Petri chứa môi trường thạch cà chua – CaCO3 rồi cấy trang vi khuẩn lactic lên mặt thạch.

Đục 5 lỗ trên mặt thạch rồi nhỏ dịch B.amyloliquefaciens đã được ly tâm tách sinh khối vào các lỗ trên thạch.

Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng vô khuẩn lactic.

 Khả năng sinh tổng hợp acid lactic của vi khuẩn lactic và độ chua của

sản phẩm

Phương pháp định lượng acid lactic : 0,1M - . : (g) - 0,1N. * Độ Therner

Một độ Therner tương đương một ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100ml nguyên liệu. % acid lactic = = = VNaOH x 0,1 x 90 x 100 m x 1000 x D

 Khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn L. casei trong sản phẩm

Cho dịch sinh khối vi khuẩn B.amyloliquefaciens vào đĩa Petri có chứa sẵn môi trường thạch CP rồi nghiêng đảo vòng, đều tay.

Đục 5 lỗ trên mặt thạch rồi nhỏ dịch nuôi vi khuẩn lactic đã được ly tâm tách sinh khối và đã được trung hòa tới pH 6,5 – 7 vào các lỗ trên thạch.

Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng vô khuẩn B.amyloliquefaciens

 Định lượng sinh khối (tế bào và bào tử) B.amyloliquefaciens của sản

phẩm

Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường CP trong đĩa Petri.

 Định lượng sinh khối của vi khuẩn L. casei của sản phẩm

Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường cà chua – CaCO3 trong đĩa Petri.

 Hàm lượng chất khô

Làm bay hơi hết hơi nước trong thực phẩm. Cân thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra được % nước và % chất khô có trong thực phẩm.

 Hàm lượng tro

Tro hóa mẫu bằng nhiệt (525 ± 25oC). Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng.

 Hàm lượng xơ tổng, xơ tan và không tan

- Xơ tổng: xác định theo phương pháp AOAC 985.29

- Xơ tan: xác định theo phương pháp AOAC 991.43

- Xơ không tan: phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính bền đối

với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin... ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch acid nitric và acid acetic.

 Xác định độ nhớt, độ đồng đều và độ ổn định của sản phẩm

- Độ đồng đều

Cho sản phẩm qua máy rây Retsch – AS 200 digit Produced: 2004

Part No. 30 015.0001 Serial No. 124230806I

Kích thước lỗ rây lớn nhất là 250 µm. Xác định tỷ lệ sản phẩm lọt qua rây.

- Độ ổn định

Quan sát mức độ tách pha của sản phẩm sau thời gian bảo quản.

2.2.3. Nội dung 3. Đảm bảo VSATTP cho sản phẩm

2.2.3.1. Thí nghiệm 1. Xác định vi sinh vật tạp nhiễm (E.coli, S.aureus,

Salmonella, Cl.perfringers, B.cereus)

E.coli: Ref. NF V08-017:1980 S.aureus: Ref. ISO 6888-3:2003 Salmonella: ISO 6579:2002 Cl.perfringers: ISO 7937:2004 B.cereus: Ref. ISO 7932:2004

2.2.3.2. Thí nghiệm 2. Định lượng kim loại nặng (Hg và Pb)

Hg: AOAC 971.21 Pb: AOAC 999.11

2.2.3.3. Thí nghiệm 3. Dư lượng thuốc BVTV (gốc Phosphor và Chlor)

Gốc Phosphor: GC-AOAC 958.22 (2002); AOAC 998.01 (2002); Australia 2114 (829-848)

Gốc Chlor: GC-AOAC 958.22 (2002); AOAC 998.01 (2002); Australia 2114 (829-848)

2.2.3.4. Phân tích hàm lƣợng Aflatoxin tổng:

2.2.4. Nội dung 4. Thử nghiệm độc tính của TUCN

2.2.4.1. Thí nghiệm 1. Độc tính cấp

 Mục đích

Xác định độc tính cấp và liều LD50 qua việc quan sát tình trạng của chuột nhắt trắng thí nghiệm từ nhẹ đến nặng. Từ đó dựa vào kết quả thu được để chọn liều làm các thí nghiệm tiếp theo.

 Nguyên tắc

Chuột nhắt trắng được chia thành các nhóm tương tự, mỗi nhóm nhận cùng một liều duy nhất thuốc khảo sát, theo các điều kiện ổn định, sau đó xác định phân xuất tử vong trong thời gian qui định.

 Tiến hành

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng Mus musculus

- Đường thí nghiệm: uống bằng cách đưa thuốc vào thẳng dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.

- Liều thí nghiệm: từ liều lâm sàng cho đến liều tối đa mà cơ thể chuột có thể dung nạp được.

- Thời gian theo dõi: 72 giờ  Chỉ tiêu theo dõi

- Hoạt động của chuột sau khi uống thuốc và trong 72 giờ. - Tình trạng ngộ độc trước khi chết (nếu có).

- Phân suất tử vong trong từng lô thí nghiệm * Liều LD50 tính theo công thức Karber – Behrens

LD50 =

N ab Df

Trong đó: LD50: là liều làm chết 50% động vật thí nghiệm

Df: là liều tối thiểu làm chết 100% động vật thí nghiệm a: trị số trung bình số súc vật chết giữa 2 liều kế tiếp b: hiệu số giữa 2 liều thử nghiệm kế tiếp

2.2.4.2. Thí nghiệm 2. Độc tính bán cấp

 Mục đích

Khảo sát độc tính của thuốc, tiên đoán phần nào tác dụng phụ nếu có của thuốc thông qua việc theo dõi những biến chuyển trên động vật trong thời gian dùng thuốc dài ngày.

 Nguyên tắc

Chuột chia làm hai lô gồm lô chứng và lô thử. Lô chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống chất khảo sát. Cả hai lô đều được nuôi trong cùng điều kiện và thí nghiệm cùng thời điểm như nhau.

 Tiến hành

- Động vật: chuột cống trắng, trọng lượng P = 200 ± 20g, số lượng n = 20 con, chia làm 2 lô gồm thử và chứng, mỗi lô 10 con.

- Đường thí nghiệm: uống bằng kim cong đầu tù đưa thẳng vào dạ dày chuột. - Liều thí nghiệm:

+ Lô thử: uống 1,5 ml thức uống chức năng / 100 g chuột cống trắng.

+ Lô chứng: uống nước cất 1,5 ml / 100 g chuột - Thời gian thử nghiệm: 60 ngày.

 Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá kết quả

- Tình trạng sinh hoạt chung của lô chứng và lô thử trước, trong và sau thí nghiệm.

- Theo dõi trọng lượng của lô chứng và lô thử trước, trong và sau thí nghiệm. - Xét nghiệm huyết học và sinh hóa trước và sau thí nghiệm.

- Giải phẫu bệnh: sau thí nghiệm mổ quan sát đại thể và vi thể các cơ quan