Kt qu t́ch chit DNA

V t li us d ng cho đ́nh gí t́nh kh́ng đo ôn, bc ĺ v̀ h̀m l ng amylose

P HN III.K T QU NGHIÊN CU & THO L UN

3.1.1. Kt qu t́ch chit DNA

DNA b gene c a 85 dòng ĺađ c tách chi t b ng ph ng ph́p CTAB c i bi n s d ng lá non 2 tu n tu i. DNA sau khi tách chi t đ c đi n di trên gel agarose 1% trong th i gian 45 ph́tđ ki m tra hi u qu tách chi t, đ đ t gãy, th c hi n theo qui tr̀nh t́ch chi t c a ph̀ng nghiên c u marker phân t , tr c thu c trung tâm nghiên c u Gi ng cây trông Mi n Nam, đã xây d ng thành qui tr̀nh chu n, đ m b o DNA t́ch chi t đ ng đ u v ch t l ng, s d ng cho ćc nghiên c u. K t qu đi n di DNA tách chi t đ c th hi n hình

d i đ i di n cho ch t l ng DNA t́ch chi t theo qui chu n c a ph̀ng nghiên c u marker phân t [66, 78]:

D a vào k t qu hình 3.1, đi n di trên gel agarose 1 %, chúng tôi nh n th y t t c các gi ng đ u có 1 b ng śng rõ (> 1000 bp), không t o v t śng tr ng (smear); không b nhi m, l n protein do không xu t hi n v̀ng śng t i v tŕ gi ng. T đó có th k t lu n, DNA tách chi t có ch t l ng t t, ít b đ t gãy, DNA thu đ c đ ng đ u gi a các m u. DNA này có th đ c s d ng cho qú tr̀nh phân t́ch gen kh́ng Xa7 và Xa21.

45

3.1.2. K t qu đ́nh gí marker s d ng trong đ́nh gí ki u gen kh́ng b c ĺ 3.1.2.1. K t qu đ́nh gí s b v marỆỀr pTA248 và RM5509:

M i sau khi đ c t ng h p c n đ c ki m tra kh n ng ho t đ ng tr c khi s d ng

đ th c hi n các thí nghi m ti p theo. đ́nh gí kh n ng ho t đ ng c ng nh ḱch th c

đo n s n ph m khu ch đ i c a m i, chúng tôi ti n hành th c hi n ph n ng PCR trên DNA c a m t s d̀ng ĺa nh sau:

Ki m tra m i pTA248: DNA gi ng ĺa IR7, IR24, IRBB21. Trong đó, m u IR7 đ c s d ng nh m u ch ng kh́ng mang gen Xa21, m u IR24 đ c s d ng nh m u ch ng nhi m.

Ki m tra m i RM5509: DNA gi ng ĺa IR7, IR24, IRBB21. Trong đó, m u IRBB21

đ c s d ng nh m u ch ng kh́ng mang gen Xa7, m u IR24 đ c s d ng nh m u ch ng nhi m.

Thành ph n ph n ng nh b ng 2.4.

Nhi t đ b t c p s d ng cho ph n ng là 55 0C.

Sau khi th c hi n ph n ng PCR và đi n di trên gel agarose 2%, ch́ng tôi đ c k t qu nh sau:

H̀nh 3.2. K t qu ch y ki m tra marker Xa21 trên các dòng chu n kháng, chu n nhi m trên gel agarose 2%.

46 D a vào k t qu trên hình 3.2, ch́ng tôi nh n th y: m i khu ch đ i cho ra s n ph m

t ng đ ng kho ng 1000 bp so v i thang DNA 100 bp. K t qu này hoàn toàn t ng th́ch

v i k t qu trên lý thuy t, c ng nh k t qu tham kh o t các nghiên c u tr c. D a theo

ḱch th c có th chia các m u thành 2 nhóm, m u mang gen kh́ng Xa21 n m trên v i ḱch th c kho ng 1000bp, m u n m d i không mang gen kh́ng v i ḱch th c kho ng

750 bp.

Nh v y, d a vào k t qu trên, ch́ng tôi nh n th y c p m i có kh n ng khu ch đ i đo n s n ph m PCR đ́ng v i ḱch th c m c tiêu [24, 49, 28] và có th đ c s d ng trong các kh o sát ti p theo.

Nh v y, ch́ng tôi s d ng c p m i pTA248 trong nghiên c u gen kh́ng Xa21 trên gel agarose 2% cho ra k t qu phân bi t n đ nh.

H̀nh 3.3. K t qu ch y ki m tra marker Xa7 trên ćc d̀ng chu n kh́ng, chu n nhi m trên gel agarose 2%

D a vào k t qu trên hình 3.3, chúng tôi nh n th y: m i khu ch đ i cho ra s n ph m

b ng h̀nh m không th y rõ s kh́c bi t gi a gi ng ĺa mang gen kh́ng Xa7 v i gi ng chu n nhi m và gi ng ĺa mang gen kh́ng Xa21. i v i gene Xa7, gel agarose không có kh n ng nh n di n đ c s khác bi t gi a dòng chu n kháng, chu n nhi m, ch́ng tôi ti n hành đi n di s n ph m PCR kh ch đ i mang gen kh́ng Xa7 trên gel polyacrylamide. Do trong thí nghi m này c n gel có đ phân gi i cao đ phân t́ch ćc b ng có ḱch th c nh

đ đ́nh gí s t ng th́ch gi a marker v i ki u hình, ch́ng tôi s d ng gel polyacrylamide 4,5% đ phân tích k t qu PCR [49].

47 D a vào k t qu trên hình 3.4, ch́ng tôi nh n th y: m i khu ch đ i cho ra s n ph m

t ng đ ng kho ng 258 bp so v i thang DNA 200 bp. K t qu này hoàn toàn t ng th́ch

v i k t qu trên lý thuy t, c ng nh k t qu tham kh o t các nghiên c u tr c. D a theo

ḱch th c có th chia các m u thành 2 nhóm, m u không mang gen kh́ng có ḱch th c kho ng 255 bp và 260 bp ,m u mang gen kh́ng Xa7 n m gi a có ḱch th c kho ng 258

bp.

C ng d a theo k t qu h̀nh trên nh n th y r ng, khi s d ng gel có đ phân gi i không

cao (gel agarose) có th gây ra nh m l n gi a m u có và không mang gen Xa7. Do v y, c n s d ng gel có đ phân gi i cao (gel polyacrylamide) đ nh n di n đ c s kh́c bi t gi a s n ph m khu ch đ i gi a m u mang gen Xa7 và không mang gen Xa7.

D a vào b ng h̀nh trên, chúng tôi nh n th y c p m i có kh n ng khu ch đ i đo n s n ph m PCR đ́ng v i ḱch th c m c tiêu [59, 77, 15] và có th đ c s d ng trong các kh o sát ti p theo. Trong nghiên c u này, do không có thang DNA đ́ng v i ḱch th c c a

ćc đo n s n ph m kh o sát nên chúng tôi ch c l ng ḱch th c d a trên lý thuy t và so v i thang chu n 100 bp, ćc b ng m c tiêu c a m i n m gi a b ng 200 bp và 300 bp, kh p v i k t qu tham kh o ćc nghiên c u đã s d ng c p m i

Nh v y, gel agarose không thích h p đ đ́nh gí c p m i RM5509 liên k t v i gen kh́ng Xa7, c n ti n hành trên gel polyacrylamide 4,5 %cho ra k t qu phân bi t n đ nh.

a b c

H̀nh 3.4. Ch y marker Xa7 trên gel polyacrylamide 4,5%. a c b

48

3.1.2.2. K t qu t i u ph n ng PCR-SSR/STS c a marỆỀr ệiên Ệ t gỀn Ệh́ng b c ệ́

T t c các quy trình t i u bên d i đ u s d ng DNA tách chi t t 2 gi ng ĺa IR7 và IRBB21 đ ki m tra nhi t đ t i u c a m i Xa21 và Xa7, các thí nghi m này ch c n quan sát s hi n di n, đ đ m nh t c a ćc b ng đ ki m tra các thông s mà không c n

phân t́ch ćc b ng nên ch́ng tôi ch th hi n k t qu trên gel agarose 2% v i k t qu sáng,

rõ và đ p.

Sau khi ti n hành ch y PCR kh o sát nhi t đ b t c p nh tr̀nh bày trên. S n ph m

PCR đ c đi n di trên gel agarose 2%, ch́ng tôi đ c k t qu nh bên d i:

H̀nh 3.5. K t qu kh o sát nhi t đ t i u c a m i Xa21 trên gel agarose 2%

H̀nh 3.6. K t qu kh o sát nhi t đ t i u c a m i Xa7

K t qu đi n di trên h̀nh 3.5 và h̀nh 3.6, đ i v i c 2 c p m i PTA248 và RM5509,

ch́ng tôi nh n th y, c p m i Xa7 t t c nhi t đ đ u cho duy nh t m t b ng v i đ sáng g n nh t ng đ ng nhau, c p m i Xa21 cho ra 2 b ng h̀nh v i đ śng rõ t 60,2oC đ n

65 oC. Trong đó, nhi t đ kho ng 60oC cho b ng śng t t c hai m i. Chính vì v y,

ch́ng tôi quy t đnh ch n nhi t đ 60oC làm nhi t đ t i u cho c hai m i và s d ng đ đ́nh gí b t c p marker RM5509 và pTA248 v i gen kh́ng Xa7 và Xa21.

5 0 b p 5 0 b p

49

3.1.2.3. K t qu Ệh o śt đ ệ p ệ i c a qui trình t i u trên v i t́nh Ệh́ng b c ệ́.

Kh o śt t́nh Ệh́ng b c ệ́ trên 17 m u ệ́a ệà con ệai c a d̀ng u t́

V i các thông s đ c t i u trên, chúng tôi ti n hành kh o sát quy trình trên m t s m u v i 3 l n l p l i khác nhau (v i DNA tách chi t t 3 cây riêng l ) đ ki m tra tính

n đ nh c a quy trình và t́nh t ng đ ng v i ki u h̀nh qua kh o śt ćc gi ng ĺa mang gen kh́ng. th c hi n thí nghi m này, chúng tôi th c hi n ph n ng PCR v i 17 m u ĺa là d̀ng con lai gi a d̀ng kh́ng và d̀ng u t́ đã đ c li t kê b ng 2.1, do SRC cung c p, d̀ng chu n kh́ng và chu n nhi m theo ngu n gi ng vi n ĺa IRRI.

K t qu thu đ c:

K t qu trên hình 3.7, ch́ng tôi nh n th y có 7 m u mang gen kh́ng Xa21 hi n th trên b ng h̀nh. K t qu l p l i c 3 l n đ cho ra b ng h̀nh t ng đ ng, h̀nh 3.7 là đ i di n cho 3 l n l p l i.

50

H̀nh 3.8. K t qu ch y b ng h̀nh c a m u Xa7 trên gel polyacrylamide 4,5%.

K t qu trên hình 3.8, ch́ng tôi nh n th y có 5 m u có mang gen kh́ng Xa21 qua hi n th trên b ng h̀nh. K t qu l p l i c 3 l n đ u cho ra b ng h̀nh t ng đ ng, h̀nh 3.8 là đ i di n cho 3 l n l p l i.

51

B ng 3.1.a. K t qu phân t́ch m u gen kh́ng Xa21 v i k t qu ki u h̀nh m u ĺa đ̃ đ c ki m tra. STT Ḱ Hi u TểN M U GENE XA21 Ki u h̀nh K t Lu n L n 1 L n 2 L n 3 KL 1 KB8 TBL8 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 2 KB9 TBL9 - - - - 3 KB10 TBL10 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 4 KB11 TBL11 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 5 KB12 TBL12 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 6 KB13 TBL13 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 7 KB14 TBL14 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 8 KB15 TBL15 + + + Xa21 Kh́ng Xa21 9 KB16 IR24 ( /CN) - - - - 10 KB17 IRBB7 (đ/c Xa21) + + + Xa21 Kh́ng Xa21 11 KB18 TBL18 - 12 KB19 TBL19 - 13 KB20 TBL20 - 14 KB21 TBL21 - 15 KB22 TBL22 - 16 KB23 TBL23 - 17 KB24 IRBB21 (đ/c Xa7) - Ghi ch́: '+ : Allele kháng. '-: Allele nhi m.

#: Allele khác ngoài allele kháng và allele nhi m.

Ćc gi ng ĺa s d ng trong nghiên c u t KB8 đ n KB15 là d̀ng con lai gi a d̀ng u t́ và d̀ng gen kh́ng Xa21, đ c đ́nh gi ki u h̀nh qua ph ng ph́p lây nhi m nhân t o t i tr m nghiên c u ĺa lai Cai L y (SRC), đ́nh gí t́nh kh́ng t ng đ ng k t qu phân t́ch đi n di trên gel agarose 2% (l p l i 3 l n). Th hi n t́nh n đ nh và đ c hi u c a m i pTA248 liên k t v i gen kh́ng Xa21.

52

Ghi ch́:

'+ : Allele kháng. '-: Allele nhi m.

#: Allele khác ngoài allele kháng và allele nhi m.

STT Ḱ Hi u TểN M U GENE XA7 Ki u h̀nh K t Lu n L n 1 L n 2 L n 3 KL 1 KB8 TBL8 - - - 2 KB9 TBL9 - - - - 3 KB10 TBL10 - - - 4 KB11 TBL11 - - - 5 KB12 TBL12 # # # 6 KB13 TBL13 # # # 7 KB14 TBL14 # # # 8 KB15 TBL15 # # # 9 KB16 IR24 ( /CN) - - - - 10 KB17 IRBB7 (đ/cXa21) # # # 11 KB18 TBL18 + + + Xa7 Kh́ng Xa7 12 KB19 TBL19 + + + Xa7 Kh́ng Xa7 13 KB20 TBL20 + + + Xa7 Kh́ng Xa7 14 KB21 TBL21 + + + Xa7 Kh́ng Xa7 15 KB22 TBL22 + + + Xa7 Kh́ng Xa7 16 KB23 TBL23 -/# -/# -/# - 17 KB24 IRBB21 (đ/c Xa7) + + + Xa7 Kh́ng Xa7

B NG 3.1.b.: K t qu phân t́ch m u gen kh́ng Xa7 v i k t qu ki u h̀nh m u ĺa đ̃ đ c ki m tra.

Ćc gi ng ĺa s d ng trong nghiên c u t KB18 đ n KB23 là d̀ng con lai gi a d̀ng u t́ và d̀ng gen kh́ng Xa7, đ c đ́nh gi ki u h̀nh qua ph ng ph́p lây nhi m nhân t o t i tr m nghiên c u ĺa lai Cai L y (SRC), đ́nh gí t́nh kh́ng gi ng ĺa t ng đ ng k t qu phân t́ch đi n di trên gel polyacrylamide 4,5% (l p l i 3 l n). Th hi n t́nh n đ nh và đ c hi u c a m i RM5509 liên k t v i gen kh́ng Xa7, ́p d ng cho công t́c ch n t o gi ng hi n đ i. Trong đó con lai KB23 không mang gen kh́ng đ c nh n di n trên c đ́nh gí ki u h̀nh và ki u gen.

53

3.1.3. K t qu đ́nh gí s b v marker liên k t gen kh́ng đ o ôn

Trong nghiên c u này, nhóm nghiên c u ti n hành đ́nh gí s b 7 marker:

RM208, RM3431, RM543, RM206, RM28130, RM1261, RM27933 th hi n rõ s kh́c bi t gi a chu n kh́ng và chu n nhi m s d ng trong nghiên c u.

M i sau khi đ c t ng h p c n đ c ki m tra kh n ng ho t đ ng tr c khi s d ng

đ th c hi n các thí nghi m ti p theo. đ́nh gí kh n ng ho t đ ng c ng nh ḱch th c

đo n s n ph m khu ch đ i c a m i, chúng tôi ti n hành th c hi n ph n ng PCR trên DNA c a m t s d̀ng ĺa nh sau: DNA gi ng ĺaJasmin85, OM3536, IR7, ITA212, IR24, IR64, OM6976.

Ki m tra m i RM208, RM3431, RM543, RM206, RM28130, RM1261, RM2793. Trong

đó, m u IR72, ITA212 đ c s d ng nh m u ch ng kh́ng đ o ôn, m u Jasmine85, OM3536, OM6976 đ c s d ng nh m u ch ng nhi m đ o ôn, m u IR24 và IR64 là ćc m u kh́ng v i b nh đ o ônnh ng mang ćc gen kh́ng kh́c v i gen kh́ng đ o ôn s d ng trong nghiên c u này.

Thành ph n ph n ng nh b ng 2.4.

Nhi t đ b t c p s d ng cho ph n ng là 55 0C.

Sau khi th c hi n ph n ng PCR và đi n di trên gel polyacrylamide 4,5%, chúng tôi

đ c k t qu nh sau( b ng h̀nh đ i di n):

H̀nh 3.11. S n ph m b ng h̀nh

marker RM28130 trên gel polyacrylamide 4,5%

H̀nh 3.10. S n ph m b ng h̀nh marker RM1261 trên gel

polyacrylamide 4,5% H̀nh 3.9. S n ph m b ng h̀nh marker RM27933 trên gel polyacrylamide 4,5% 175bp 170bp 167bp 150bp 434bp 400bp

54

B ng 3.2. K t qu b ng h̀nh qua đ́nh gí s b 7 marker liên k t gen kh́ng đ o ôn

trên gel polyacrylamed 4,5%

Marker RM208 RM3431 RM543 RM206 RM28130 RM1261 RM27933 K t qu

Gene

kháng

Ki u hình

Pib Piz Pi37 Pikh Pi40 Pi41 Pi39 S

l ng Jasmin 85 Nhi m n ng (C/N) - - - - - - - 0 OM3536 Nhi m + - + - - - - 2 OM6976 Nhi m nh + + + - - - - 3 IR72 Chu n Kháng + + + + + + + 7 ITA212 Chu n Kháng + + + + + + + 7 IR24 Nhi m nh + - + - - # - 2 IR64 Nhi m nh + - - - - - - 1 Ghi ch́: + : Allele kháng. -: Allele nhi m.

#: Allele khác ngoài allele kháng và allele nhi m.

V i t́nh tr ng kh́ng đ o ôn ćc gi ng chu n kh́ng là ćc gi ng kh́ng đa gen ch a nhi u gen kh́ng kh́c nhau trên c̀ng m t gi ng kh́ng nh : IR72 có ch a ćc gen Pi-ta, Pib, Piz, Pikh, Pi-2… kh́ng b nh đ o ôn, IR64 ch a ćc gen Pi25, Pi27, Pi28, Pi29, Pi30, Pi33, Pi-2… [81, 85, 73]. Do v y, đ l a ch n chu n kh́ng ch́nh x́c s d ng trong ch n t o gi ng b c đ u, c n ph i ti n hành đ́nh gí s b ćc marker liên k t v i nhi u gen kh́ng đ l a ch n ra chu n kh́ng đ o ôn th́ch h p đ s d ng nh n di n ćc gi ng ĺa có t́nh kh́ng đ o ôn. D a vào b ng, ch́ng tôi nh n đ nh đ c, chu n kh́ng IR72, và ITA212 ch a t t c ćc gen kh́ng qua kh o śt 7 marker liên k t v i ćc gen kh́ng đ o ôn th ng đ c nghiên c u t i Vi t Nam, s d ng cho ch n t o gi ng, k t qu b ng h̀nh có s kh́c bi t gi a chu n kh́ng và chu n nhi m. T k t qu b ng 3.2, nh n th y IR64 c ng mang

gen Pib và IR24 mang gen Pib, Pi37 kh́ng đ o ôn, nh ng không đ c s d ng ph bi n