P HN I.T NG QUAN TÀI LIU
1.3.4. T̀nh h̀nh nghiên cus d ng gen kh́ng đo ôn trong chn to ging
Ph m V n D và cs đã lây nhi m 158 isolates c a 3 nhóm n m chính gây b nh đ o ôn (L1, L2 và L4) v̀ng ng b ng sông C u Long ( BSCL) trên 31 gi ng đ n gen mang
l n l t 24 gen kháng b nh đ o ôn (Pia, Pia, Pii, Pik-s, Pik-s, Pik, Pik-p, Pik-h, Piz, Piz5, Piz-t, Pita, Pita, Pib, Pit, Pish, Pish, Pi1, Pi3, Pi5(t), Pi7(t), Pi9(t), Pi12(t), Pi19(t), Pik-m, Pi20(t), Pita-2, Pita-2, Pita, Pi11(t) và Piz-5) cho th y t l isolates thu c nhóm L1 t n công các gen kháng bi n đ ng t 0% - 98%, nhóm này không t n công đ c m t s gen kháng
nh Pik-s, Pik-p, Pik-h, Piz, Pita, Pi5(t), và Pi19(t), t ng đ ng v i t l 73%, 100%, 95%, 98%, 100%, 93%, và 93%. Nhóm L2 không t n công đ c các gen kháng Pik, Pik-p, Pik-h, Pi1, Pi7(t), và Pik-m v i t l 100%, 97%, 94%, 94%, 97% và 97%. Isolates thu c nhóm L4 r t đ c t n công đ c t t c các gen kháng v i t l r t cao bi n đ ng t 46% - 100%. ́nh
giá chung cho th y, trong 24 gen kháng th nghi m không có m t gen nào còn hi u l c hoàn toàn v̀ng BSCL. Tuy nhiên, hai gen Piz và Pik-m có t l isolates n m gây b nh đ o ôn t n công th p nh t là 25%. Hai gen này có th đ c s d ng trong ch ng tr̀nh lai t o gi ng kháng b nh đ o ôn [17].
ch n l c cá th mang gen kháng m t cách chính xác và nhanh chóng chúng ta ph i dùng ch th phân t x́c đ nh s có m t c a gen kháng và ki m tra h gen trong con lai, đi n h̀nh nh nghiên c u d i đây:
18
Lã Tu n Ngh a và cs (2009) đã lây nhi m nhân t o đ x́c đ nh ćc gen kh́ng hi u qu qua s d ng ph ng ph́p lây nhi m nhân t o v i b gi ng ch th do IRRI cung c p và ćc d̀ng ĺa thu n c a Vi t Nam, cho th y hai gen Pi-1 và Pi-5 kh́ng t t nh t v i ćc ǹi n m nh ng v̀ng sinh th́i nông nghi p mi n B c, t l kh́ng v i ćc ǹi n m đ u r t cao
(Pi-1 là 82%; Pi-5 là 78%) (B ng 1.9). Các gen kh́ng nói trên s đ c s d ng đ qui t vào gi ng/d̀ng ĺa đ c i t o t́nh kh́ng [11].
1.4. Ćc y u t c u thƠnh ch t l ng cơy ĺa
Ch t l ng h t g o bao g m: ch t l ng xay chà, ch t l ng c m và ch t l ng dinh
d ng. Th hi u c a ng i tiêu dùng th ng ch́ Ủ đ n ch t l ng c m sau khi n u. Ch t
l ng c m bao g m hàm l ng amylose, đ tr h , đ b n th gel; hàm l ng dinh d ng bao g m l ng protein, vitamin, khóng vi l ng. Hi n nay m t trong nh ng ch tiêu đ́nh
giá ch t l ng c a m t gi ng lúa đó là hàm l ng amylose (AC) cao, th p hay trung bình. V i nh ng gi ng lúa cho g o có hàm l ng amylose cao th ng lâu ch́n, c m khô và c ng khi đ
ngu i, g o có hàm l ng amylose th p ho c r t th p th ng d́nh không t i c m, trong khi đó
g o có hàm l ng amylose trung b̀nh th ng t i c m n không ŕp và không c ng khi đ
ngu i nên đ c ng i tiêu d̀ng a chu ng. Do đó ch n t o các gi ng hàm l ng amylose trung bình là v n đ c p thi t [16, 27].
1.4.1. Gia t ng ph m ch t ĺa g o
Gia t ng ph m ch t lúa g o đ c hi u theo hai n i dung l n: ph m ch t th ng m i và ph m ch t dinh d ng. Vi c gia t ng ph m ch t lúa g o c n đ c xây d ng trên chi n l c kinh doanh và chi n l c an ninh l ng th c qu c gia.Tr c 1990, 80% gi ng lúa Vi t Nam
có hàm l ng amylose cao (>25%). Sau đó t l này gi m d n, v i nh ng gi ng lúa ch l c h t dài, hàm l ng amylose th p đ n trung bình, c nh tranh đ c v i g o tr ng Thái Lan (chúng ta ch thua so v i g o th m Th́i, v̀ h s d ng gi ng truy n th ng). ó là c m t giai
đo n c i ti n vô c̀ng khó kh n t́nh tr ng hàm l ng amylose (AC) do gen waxy đi u khi n trên nhi m s c th s 6 [16, 32].
Cùng v i s phát tri n nhanh chóng c a công ngh sinh h c và tin h c đã cho phép chúng ta ti p c n các y u t liên quan quy t đ nh ch t l ng lúa g o m c phân t , đ c bi t hàm
19 bi n đ i c a amylose trong h t g o c p đ phân t s cho phép chúng ta, các nhà khoa h c, nhà ch n gi ng ng d ng vào nghiên c u và ch n t o các gi ng m i có n ng su t, ch t l ng v i hàm l ng amylose h p lý [18, 19, 60].
1.4.2. Phơn t́ch đ c t́nh h́a h c c u thƠnh nên amylose
1.4.2.1. C u t o amyệosỀ:
Amylose là polysaccarit m ch th ng đ c t o nên t các phân t -D-glucose nh các liên k t -1,4-glucoside. M i liên k t glucoside đ c t o ra s lo i m t phân t H2O. Amylose
đ c t o ra t 5000 - 1000 phân t -D-glucose ho c có khi ch kho ng 250 - 300 phân t . Chu i phân t glucose xo n l i v i nhau theo hình xo n lò xo. S hình thành d ng xo n lò xo là do s hình thành các liên k t hydro gi a các glucose t o ra. M i vòng xo n có 6 đ n v glucose và đ c duy trì b i liên k t hydro v i các vòng xo n k bên. Kho ng không gian gi a các vòng xo n có ḱch th c phù h p cho m t s phân t khác có th liên k t vào, ví d nh
iodine. Khi phân t iodine liên k t vào vòng xo n s làm cho các phân t glucose thay đ i v trí chút ít và t o nên ph c màu xanh th m đ c tr ng. Ễi l c c a amylose v i iodine ph thu c tuy n tính v i chi u dài c a m ch polymer.
D ng xo n c a amylose ch t o thành trong dung d ch nhi t đ th ng. Khi nhi t đ
cao chu i xo n s b du i th ng ra và không có kh n ng liên k t v i các phân t khác [10].
1.4.2.2. Hàm ệ ng amyệosỀ:
Tinh b t - ch t trùng h p c a glucose – là c u t chính c a g o, chi m kho ng 90% tr ng
l ng khô. Nó hi n di n d i d ng nh ng h t đa di n ph c h p, có ḱch th c 3 - 9 m. Tinh
b t bao g m thành ph n m ch nhánh (amylopectin) là ch y u và lo i m ch th ng (amylose). D a trên c s hàm l ng amylose, g o đ c phân làm [10, 13]:
20
B ng 1.5. H th ng đ́nh gí h̀m l ng amylose theo tiêu chu n vi n lúa IRRI (1988) [46]. [46]. Lo i g o % Amylose N p R t th p Th p Trung bình Cao 1-2 2-9 10-20 20-25 25-30
Trong g o hàm l ng amylose ph bi n t 15 t i 35%. G o có hàm l ng amylose cao
c m s n nhi u và d tróc, nh ng khô c m và c ng khi ngu i. Ng c l i, g o có hàm l ng amylose th p khi n u ít n , c m m m và d o. Ph n l n các qu c gia tr ng lúa thích lo i g o
có hàm l ng amylose trung bình, ngo i tr các gi ng japonica th ng có hàm l ng amylose th p.
Th i gian t n tr làm cho n ng su t g o nguyên và g o nói chung thu đ c cao h n; kh n ng h p th n c và đ n l n h n, s m t mát tính r n ch c trong khi n u n ng th p h n và đ b , đ c ng c a c m cao h n [60, 27].
1.4.3. V̀ng gen qui đ nh amylose
1.4.4.1. Nghiên c u v gỀn qui đ nh amyệosỀ:
Các nghiên c u đã ch ra m t s enzyme ch y u tham gia t ng h p tinh b t:ADP glucophosphate synthetase (AGPase) ho t hoá glucose 1 phosphate thành ADP glucose (Pressis et al 1991). Granule – bound starch synthase (GBSS) g n các ADP –glucose vào đo n m i b t đ u t đ u không kh b ng liên k t 1-4 glycozid. Enzym SBE c t chu i liên k t 1-4 glucan và t o liên k t – (1-6) glucan t o nên các phân t amylopectin. Enzyme Ganule bound
starch synthase GBSS đ c mã hoá b i gene Wx nhi m s c th s 6 (Okagaki wessler 1988).
Soluble starch synthase (SSS) c ng có t́c đ ng đ n s t o m ch nhánh. Tuy nhiên SBE có vai trò ch y u t i s t ng h p amylopectin. Trình t c a gene Wx trên gi ng O. Sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bp g m 14 Exon, 13 Intron (Wang, et al 1990); Trên c s
21
hàm l ng GBSS trong các loài non-Waxy, đã t̀m th y 2 alen Waxy là Wxa, Wxb l n l t trên loài ph Indica và Japonica, còn lúa n p là alen l n wx (Sano 1980). M t s nghiên c u
kh́c c ng ch ra r ng trên locus Wx có ít nh t 3 alen có ch c n ng kh́c nhau Wxa, Wxb, wx l n l t trong các loài Indica, Japonica và lúa n p (Sano, 1984) [69, 60, 84].
Khi so sánh gi a 2 alen Wxa và Wxb Y. Sano, M.Kasumata (1986) th y r ng Wxa t ng c ng ho t đ ng c a GBSS, do đó làm t ng hàm l ng amylose trong n i nh h t h n so v i Wxb. so sánh trình t Wxb và Wxa cho th y có s thay th m t nu G b i T t i v trí c t n i intron 1 (trình t c t n i t đ u 5’ c a intron 1 c a Wxa là AGGTATA, c a Wxb là AGTTATA). K t qu làm gi m hàm l ng mRNA thành th c d n đ n gi m GBSS t o thành, t đó gi m hàm
l ng amylose (Sano 1984, Hirano 1998) [43]. Hiro- Yuki Hirano và cs (1998) s d ng t bào tr n đ nghiên c u ch c n ng gen waxy
thông qua s bi u hi n c a gen gus, k t h p phân tích Nothern blot. K t qu cho th y v i loài mang gen Wxa có quá trình sao mã cao và gen GUS ho t
đ ng m nh, v i loài mang gene Wxb thì cho m c hoàn thành quá trình sao mã gi m và gene GUS ho t đ ng y u. Trên c s đó t́c gi đã phân ćc
loài lúa theo m c ti n hó đ c th hi n hình
1.3. Hai loài O. barthii và O.Rufipogon đ u có ki u gene Wxa, hàm l ng amylose cao, đ c hình thành t t tiên hoang d i c a ch́ng c ng
mang gene Wxa và cho hàm l ng amylase cao.
Loài ph O.glaberrima mang gene Wxa đ c ti n hóa t O. barthii. Hai loài ph O. sativa indica và O. sativa japonica có t tiên là O. Rufipogon, nh ng indica mang gene Wxa v i hàm
l ng amylose cao còn loài japonica mang ki u gen có ch a đ t bi n Wxb cho hàm l ng amylase trung bình [42, 80].
Khi x́c đnh trình t l p TC (TC repeats) Hirano và cs s d ng SSR và nhân lên trình t microsatellite DNA có ch a tr̀nh v̀ng nu đ t bi n đ u 5’ intron 1. Hình 1.4 [43]
22
H̀nh 1.4. Tr̀nh t SSR v̀ng nu đ t bi n, thao kh o t Hirano v̀ c ng s .
K t lu n: Gen Waxy liên k t ch t v i t́nh tr ng qui đ nh hàm l ng amylose trong h t ĺa và là tiêu ch́ quan tr ng cho ph m ch t gi ng ĺa, nh t là gen Wxb qui đ nh hàm l ng amylose trung b̀nh, ng d ng t t qua ćc nghiên c u trên gi ng ĺa Vi t Nam nh :
Gi ng lúa OM576 hay còn có tên g i là gi ng Hàm Châu đ c lai t o và ch n l c t t h p lai gi a gi ng IR48 và gi ng Hungary. Gi ng lúa này đ c nhi u nông dân a chu ng vì th i gian sinh tr ng ng n, n ng su t cao, ch ng ch u sâu b nh và kh n ng th́ch nghi
t t. Tuy nhiên, nh c đi m c a OM576 là hàm l ng amylose cao t 25 - 26%, nên r t c ng
c m. Có nhi u công trình nghiên c u ch ng minh r ng hàm l ng amylose đ c ki m soát b i locus Wx n m trên vùng vai ng n c a nhi m s c th s 6. Vì v y, hàm l ng amylose c a gi ng này đ c c i thi n b ng cách du nh p gene có hàm l ng amylose th p t gi ng
ĺa VD20 thông qua ph ng ph́p lai h i giao. Hai ch th RM190 và RM510 đ c s d ng
đ ch n l c nh ng con lai mang alen c a VD20 và OM576 trong qu n th h i giao BC1F1
và ki m tra l i trong qu n th BC2F1. M c đ chính xác gi a ki u gen và ki u hình c a ch th RM190 c a nh ng cá th mang gen Aa là 81,63%, và c a RM510 là 76,07%. M c đ
chính xác gi a ki u gen và ki u hình c a nh ng cá th mang gen AA đ i v i ch th RM190 là 64,58%, và ch th RM510 là 59,18%. K t qu này t o ti n đ cho công tác ch n t o gi ng
ĺa có hàm l ng amylose th p và trung bình b ng ch th phân t [20].
Ngoài ra có th k t h p s d ngcó th s d ng enzyme c t AccI đê phân c t s n ph m PCR c a marker RM190 (CAPS) nh n di n nhóm gi ng ĺa trên th tr ng có hàm l ng
amylose th p v i nhóm gi ng ĺa có hàm l ng amylose trung b̀nh và cao nh nghiên c u:
Ćc tr̀nh t l p đ n gi n v̀ng đa h̀nh c a Waxy (Wx) và G-T nucleotide đ n h̀nh (SNP) trên v̀ng gen Wx là ćc k thu t phân t́ch đ n gi n s d ng trên 18 gi ng ĺa kh́c nhau.
23
V i ph ng ph́p đi n di nhanh chóng và đ́ng tin c y. Ti n hành đi n di trên gel MetaPhor (MAGE) nh m thay th cho đi n di trên gel polyacrylamide (PAGE), đ phân t́ch tr̀nh t l p gen Wx. S n ph m khu ch đ i c a tr̀nh t l p cho ḱch th c kho ng 100 bp đ n 130 bp. V i 5 tr̀nh t l p c a Wx, mang tên (CT)10, (CT)11, (CT)16, (CT)17, (CT)18 đ c nh n di n. Trong đó, (CT)11, (CT)17 là ćc tr̀nh t chi m u th trên ćc gi ng ĺa th nghi m. T t c ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose cao h n 24% có liên quan đ n ćc tr̀nh t l p ng n (CT)10, (CT)11; trông khi ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose 24% ho c có hàm l ng amylose th p h n liên quan đ n ćc tr̀nh t l p dài h n. T t c ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose trung b̀nh và cao có tr̀nh t AGGTATA t i v tŕ c t n i v̀ng intron đ u 5’. Trong khi ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose th p có tr̀nh t AGTTATA. Ćc G-T đa h̀nh ti p t c đ c ki m ch ng thêm b ng ph ng ph́p PCR-AccI phân c t s n ph m tr̀nh t khu ch đ i đa h̀nh (CAPS). Trong đó, ch ki u gen có ch a chu i AGGTATA b phân c t b i ezyme
AccI. Do đó, ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose mong mu n có th nh n di n nhanh chóng b ng ćch ́p d ng tr̀nh t l p đ n gi n Wx và G-T SNP c̀ng v i MAGE [25, 84, 27].
1.4.4.2. Tình hình nghiên c u s d ng gỀn qui đ nh amyệosỀ trong ch n t o gi ng Vi t Nam:
Hàm l ng amylose ch u nh h ng c a t ng t́c: t́nh c ng x tính c ng, và t ng t́c
tr i x tr i, trong phân tích epistasis. Nguy n Th Lang và công s . (2004) đã t̀m th y AC
đ c ki m soát b i gen ch́nh đ nh v trên nhi m s c th s 5 và 6 liên k t v i ch th RM42 (nhi m s c th s 5) và wx (nhi m s c th s 6) [5, 16].
Trong các tính tr ng v ph m ch t c m, hàm l ng amylose đ c xem là m t tính tr ng quan tr ng, có Ủ ngh a quy t đ nh đ n s m m c m ho c ng c l i. Hàm l ng amylose còn có tính tr i không hoàn toàn so v i hàm l ng amylose th p, nó do m t gen đi u khi n kèm theo m t s gen ph có tính ch t c i ti n v i gen Wx (gen đi u khi n hàm l ng amylose)
đã đ c công b .
M c tiêu nghiên c u quy trình ng d ng MAS nh m x́c đ nh gen Waxy đi u khi n hàm
l ng amylose trong cây lúa v i SSR marker có t́nh đa h̀nh ph trên 2 nhi m s c th 5 và 6 liên k t v i gen Wx đã đ c công b .
Hai marker WxF-R và RM42 đ c s d ng cho k t qu đa h̀nh trên ćc gi ng lúa mùa
24 qu n th phân ly t t h p IR64/Jasmine 85. K t qu phân tích t s n ph m PCR cho th y
marker này phân ly nh m t marker đ ng tr i (codominant), là đi u ki n thu n l i cho vi c