P HN I.T NG QUAN TÀI LIU
1.4.3. V̀ng gen qui đ nh amylose
1.4.4.1. Nghiên c u v gỀn qui đ nh amyệosỀ:
Các nghiên c u đã ch ra m t s enzyme ch y u tham gia t ng h p tinh b t:ADP glucophosphate synthetase (AGPase) ho t hoá glucose 1 phosphate thành ADP glucose (Pressis et al 1991). Granule – bound starch synthase (GBSS) g n các ADP –glucose vào đo n m i b t đ u t đ u không kh b ng liên k t 1-4 glycozid. Enzym SBE c t chu i liên k t 1-4 glucan và t o liên k t – (1-6) glucan t o nên các phân t amylopectin. Enzyme Ganule bound
starch synthase GBSS đ c mã hoá b i gene Wx nhi m s c th s 6 (Okagaki wessler 1988).
Soluble starch synthase (SSS) c ng có t́c đ ng đ n s t o m ch nhánh. Tuy nhiên SBE có vai trò ch y u t i s t ng h p amylopectin. Trình t c a gene Wx trên gi ng O. Sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bp g m 14 Exon, 13 Intron (Wang, et al 1990); Trên c s
21
hàm l ng GBSS trong các loài non-Waxy, đã t̀m th y 2 alen Waxy là Wxa, Wxb l n l t trên loài ph Indica và Japonica, còn lúa n p là alen l n wx (Sano 1980). M t s nghiên c u
kh́c c ng ch ra r ng trên locus Wx có ít nh t 3 alen có ch c n ng kh́c nhau Wxa, Wxb, wx l n l t trong các loài Indica, Japonica và lúa n p (Sano, 1984) [69, 60, 84].
Khi so sánh gi a 2 alen Wxa và Wxb Y. Sano, M.Kasumata (1986) th y r ng Wxa t ng c ng ho t đ ng c a GBSS, do đó làm t ng hàm l ng amylose trong n i nh h t h n so v i Wxb. so sánh trình t Wxb và Wxa cho th y có s thay th m t nu G b i T t i v trí c t n i intron 1 (trình t c t n i t đ u 5’ c a intron 1 c a Wxa là AGGTATA, c a Wxb là AGTTATA). K t qu làm gi m hàm l ng mRNA thành th c d n đ n gi m GBSS t o thành, t đó gi m hàm
l ng amylose (Sano 1984, Hirano 1998) [43]. Hiro- Yuki Hirano và cs (1998) s d ng t bào tr n đ nghiên c u ch c n ng gen waxy
thông qua s bi u hi n c a gen gus, k t h p phân tích Nothern blot. K t qu cho th y v i loài mang gen Wxa có quá trình sao mã cao và gen GUS ho t
đ ng m nh, v i loài mang gene Wxb thì cho m c hoàn thành quá trình sao mã gi m và gene GUS ho t đ ng y u. Trên c s đó t́c gi đã phân ćc
loài lúa theo m c ti n hó đ c th hi n hình
1.3. Hai loài O. barthii và O.Rufipogon đ u có ki u gene Wxa, hàm l ng amylose cao, đ c hình thành t t tiên hoang d i c a ch́ng c ng
mang gene Wxa và cho hàm l ng amylase cao.
Loài ph O.glaberrima mang gene Wxa đ c ti n hóa t O. barthii. Hai loài ph O. sativa indica và O. sativa japonica có t tiên là O. Rufipogon, nh ng indica mang gene Wxa v i hàm
l ng amylose cao còn loài japonica mang ki u gen có ch a đ t bi n Wxb cho hàm l ng amylase trung bình [42, 80].
Khi x́c đnh trình t l p TC (TC repeats) Hirano và cs s d ng SSR và nhân lên trình t microsatellite DNA có ch a tr̀nh v̀ng nu đ t bi n đ u 5’ intron 1. Hình 1.4 [43]
22
H̀nh 1.4. Tr̀nh t SSR v̀ng nu đ t bi n, thao kh o t Hirano v̀ c ng s .
K t lu n: Gen Waxy liên k t ch t v i t́nh tr ng qui đ nh hàm l ng amylose trong h t ĺa và là tiêu ch́ quan tr ng cho ph m ch t gi ng ĺa, nh t là gen Wxb qui đ nh hàm l ng amylose trung b̀nh, ng d ng t t qua ćc nghiên c u trên gi ng ĺa Vi t Nam nh :
Gi ng lúa OM576 hay còn có tên g i là gi ng Hàm Châu đ c lai t o và ch n l c t t h p lai gi a gi ng IR48 và gi ng Hungary. Gi ng lúa này đ c nhi u nông dân a chu ng vì th i gian sinh tr ng ng n, n ng su t cao, ch ng ch u sâu b nh và kh n ng th́ch nghi
t t. Tuy nhiên, nh c đi m c a OM576 là hàm l ng amylose cao t 25 - 26%, nên r t c ng
c m. Có nhi u công trình nghiên c u ch ng minh r ng hàm l ng amylose đ c ki m soát b i locus Wx n m trên vùng vai ng n c a nhi m s c th s 6. Vì v y, hàm l ng amylose c a gi ng này đ c c i thi n b ng cách du nh p gene có hàm l ng amylose th p t gi ng
ĺa VD20 thông qua ph ng ph́p lai h i giao. Hai ch th RM190 và RM510 đ c s d ng
đ ch n l c nh ng con lai mang alen c a VD20 và OM576 trong qu n th h i giao BC1F1
và ki m tra l i trong qu n th BC2F1. M c đ chính xác gi a ki u gen và ki u hình c a ch th RM190 c a nh ng cá th mang gen Aa là 81,63%, và c a RM510 là 76,07%. M c đ
chính xác gi a ki u gen và ki u hình c a nh ng cá th mang gen AA đ i v i ch th RM190 là 64,58%, và ch th RM510 là 59,18%. K t qu này t o ti n đ cho công tác ch n t o gi ng
ĺa có hàm l ng amylose th p và trung bình b ng ch th phân t [20].
Ngoài ra có th k t h p s d ngcó th s d ng enzyme c t AccI đê phân c t s n ph m PCR c a marker RM190 (CAPS) nh n di n nhóm gi ng ĺa trên th tr ng có hàm l ng
amylose th p v i nhóm gi ng ĺa có hàm l ng amylose trung b̀nh và cao nh nghiên c u:
Ćc tr̀nh t l p đ n gi n v̀ng đa h̀nh c a Waxy (Wx) và G-T nucleotide đ n h̀nh (SNP) trên v̀ng gen Wx là ćc k thu t phân t́ch đ n gi n s d ng trên 18 gi ng ĺa kh́c nhau.
23
V i ph ng ph́p đi n di nhanh chóng và đ́ng tin c y. Ti n hành đi n di trên gel MetaPhor (MAGE) nh m thay th cho đi n di trên gel polyacrylamide (PAGE), đ phân t́ch tr̀nh t l p gen Wx. S n ph m khu ch đ i c a tr̀nh t l p cho ḱch th c kho ng 100 bp đ n 130 bp. V i 5 tr̀nh t l p c a Wx, mang tên (CT)10, (CT)11, (CT)16, (CT)17, (CT)18 đ c nh n di n. Trong đó, (CT)11, (CT)17 là ćc tr̀nh t chi m u th trên ćc gi ng ĺa th nghi m. T t c ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose cao h n 24% có liên quan đ n ćc tr̀nh t l p ng n (CT)10, (CT)11; trông khi ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose 24% ho c có hàm l ng amylose th p h n liên quan đ n ćc tr̀nh t l p dài h n. T t c ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose trung b̀nh và cao có tr̀nh t AGGTATA t i v tŕ c t n i v̀ng intron đ u 5’. Trong khi ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose th p có tr̀nh t AGTTATA. Ćc G-T đa h̀nh ti p t c đ c ki m ch ng thêm b ng ph ng ph́p PCR-AccI phân c t s n ph m tr̀nh t khu ch đ i đa h̀nh (CAPS). Trong đó, ch ki u gen có ch a chu i AGGTATA b phân c t b i ezyme
AccI. Do đó, ćc gi ng ĺa có hàm l ng amylose mong mu n có th nh n di n nhanh chóng b ng ćch ́p d ng tr̀nh t l p đ n gi n Wx và G-T SNP c̀ng v i MAGE [25, 84, 27].
1.4.4.2. Tình hình nghiên c u s d ng gỀn qui đ nh amyệosỀ trong ch n t o gi ng Vi t Nam:
Hàm l ng amylose ch u nh h ng c a t ng t́c: t́nh c ng x tính c ng, và t ng t́c
tr i x tr i, trong phân tích epistasis. Nguy n Th Lang và công s . (2004) đã t̀m th y AC
đ c ki m soát b i gen ch́nh đ nh v trên nhi m s c th s 5 và 6 liên k t v i ch th RM42 (nhi m s c th s 5) và wx (nhi m s c th s 6) [5, 16].
Trong các tính tr ng v ph m ch t c m, hàm l ng amylose đ c xem là m t tính tr ng quan tr ng, có Ủ ngh a quy t đ nh đ n s m m c m ho c ng c l i. Hàm l ng amylose còn có tính tr i không hoàn toàn so v i hàm l ng amylose th p, nó do m t gen đi u khi n kèm theo m t s gen ph có tính ch t c i ti n v i gen Wx (gen đi u khi n hàm l ng amylose)
đã đ c công b .
M c tiêu nghiên c u quy trình ng d ng MAS nh m x́c đ nh gen Waxy đi u khi n hàm
l ng amylose trong cây lúa v i SSR marker có t́nh đa h̀nh ph trên 2 nhi m s c th 5 và 6 liên k t v i gen Wx đã đ c công b .
Hai marker WxF-R và RM42 đ c s d ng cho k t qu đa h̀nh trên ćc gi ng lúa mùa
24 qu n th phân ly t t h p IR64/Jasmine 85. K t qu phân tích t s n ph m PCR cho th y
marker này phân ly nh m t marker đ ng tr i (codominant), là đi u ki n thu n l i cho vi c
x́c đnh các cá th đ ng h p t và d h p t m t ćch ch́nh x́c h n. Marker WxF-R có t l ng d ng di truy n đ t 98,33% và m t QTL ki m soát trên gen quy đ nh hàm l ng amylose v i ki u hình góp ph n 14,21%. Vi c s d ng RM42 đ phát hi n gen hàm l ng amylose k t qu cho th y đây là m t marker đ ng tr i có đ chính xác cao. Nh v y, v i tính tr ng hàm l ng amylose vi c k t h p ph ng ph́p ch n gi ng truy n th ng v i
ph ng ph́p s d ng marker phân t cho vi c phát hi n nhanh và chính xác gen m c tiêu, nâng cao hi u qu và rút ng n th i gian cho công tác ch n t o gi ng, đ́p ng đ c nh ng yêu c u cho vi c xu t kh u g o [16].
PH N II: V T
LI U V̀ PH NG
PHÁP NGHIÊN C U
26
2.1. V t li u vƠ ph ng ph́p nghiên c u
2.1.1. V t li u nghiên c u
Ćc gi ng ĺa thu th p t ngu n gi ng c a Trung tâm nghiên c u gi ng cây tr ng Mi n
Nam (SRC):
V t li u s d ng cho xây d ng quy tr̀nh nh n di n gen kh́ng b c ĺ
B ng 2.1. Ćc m u ĺa đ c s d ng đ nghiên c u t́nh n đ nh c a marker liên k t v i gen kh́ng b c ĺ STT Tên m u Ki u h̀nh Ki u gen 1 TBL8 Kh́ng 2 TBL9 3 TBL10 Kh́ng 4 TBL11 Kh́ng 5 TBL12 Kh́ng 6 TBL13 Kh́ng 7 TBL14 Kh́ng 8 TBL15 Kh́ng
9 IR24 Chu n nhi m
10 IRBB21* Chu n kh́ng Xa21
11 TBL18 Kh́ng 12 TBL19 Kh́ng 13 TBL20 Kh́ng 14 TBL21 Kh́ng 15 TBL22 Kh́ng 16 TBL23
17 IRBB7* Chu n kh́ng Xa7
(*): Dòng Kh́ng b c ệ́ IR7, IRBB21 có ngu n g c t vi n ệ́a IRRI; các dòng ệ́a còn l i có ngu n g c t ngu n gi ng SRC. Ćc gi ng ệ́a s d ng trong nghiên c u t KB8 đ n KB15 ệà con ệai gi a d̀ng u t́ và d̀ng gỀn Ệh́ng Xa7, Xa21 đ c ch n t o qua đ́nh
27
gi Ệi u hình qua ph ng ph́p ệây nhi m nhân t o t i tr m nghiên c u ệ́a ệai Cai L y
(SRC).
M i s d ng cho nghiên c u:
Trong nghiên c u này, chúng tôi s d ng ćc c p m i SSR RM5509 và pTA248
cho x́c đ nh ki u gene Xa7 và Xa21 t ng ng. Trình t m i đ c t ng h p b i công ty IDT, Hoa k .
B ng 2.2. Tr̀nh t m i s d ng cho x́c đ nh gen Xa7 v̀ Xa21
Gene Marker Trình t Tham kh o
Xa7 RM5509 F: 5'- GATGATCCATGCTTTGGCC -3' R: 5'- TTCCAGCAGAAAGAAGACGC -3'
McCouch (2002) [59]
Xa21 pTA248 F: 5'- AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA -3' R: 5'-. AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA -3'
LUO Yan-
chang (2004) [56]
Các trình t m i này c ng đã đ c ki m tra các thông s Tm, c u trúc th c p, đ đ c hi u trên lý thuy t… T t c các thông s đi u n m trong tiêu chu n cho phép, đ m b o kh
n ng nhân b n t t nh t c a m i và đ c ki m tra d a trên đ́nh gí s b marker liên k t v i v̀ng gen quan tâm.
V t li u s d ng cho xây d ng quy tr̀nh nh n di n gen kh́ng đ o ôn
B ng 2. 3. Ćc m u ĺa đ c s d ng đ nghiên c u nh n di n gen kh́ng đ o ôn
STT Tên gi ng Ki u h̀nh 1 Jasmine85 C p 9 2 OM3536 C p 7.1 3 OM6976 C p 5.1 4 IR72** C p 1 5 ITA212** C p 1 6 IR64** C p 1 7 IR24** C p 2
(**): D̀ng Kh́ng o Ôn IR72, ITA212, IR64, IR24 có ngu n g c t vi n ệ́a
IRRI, ćc d̀ng ệ́a c̀n ệ i có ngu n g c t ngu n gi ng SRC.
Ghi ch́ [46]: Kháng cao: c p 1 Kháng: c p 2 -3. Kháng trung bình: c p 3.1 – 5.0 Nhi m: c p 5.1 – 7. Nhi m n ng: c p 7.1 – 9.0
28 M i s d ng cho nghiên c u:
Trong nghiên c u này, chúng tôi s d ng ćc c p m i SSR RM208, RM3431, RM543, RM206, RM28130, RM1261, RM27933 t ng ng v i ćc gen Pib, Piz, Pi37, Pikh, Pi40, Pi41, Pi39 có t́nh kh́ng đ o ôn. Trình t m i đ c t ng h p b i công ty IDT, Hoa k .
B ng 2.4. Trình t m i s d ng cho x́c đ nh gene kh́ng đ o ôn
Gene Marker Trình t Tham kh o
Pi54 RM206 F: 5'- CCCATGCGTTTAACTATTC -3' R: 5'- CGTTCCATCGATCCGTATGG -3' Sharma et al.(2005) [74] Pi41 RM1261 F: 5'- GTCCATGCCCAAGACACAAC -3' R: 5'-. GTTACATCATGGGTGACCCC -3' Qinzhong Yang et at (2009) [60] Pi40 RM28130 F: 5'- CAGCAGACGTTCCGGTTCTACTCG -3' R: 5'-. AGGACGGTGGTGGTGATCTGG -3' Qinzhong Yang et at (2009) [60] Piz RM3431 F: 5'- ATCCAAATCCAATGGTGC -3' R: 5'-. GCGAAAGGGAACATTCTG -3' Eizenga G. C. et. al (2006) [39] Pib RM208 F: 5'- CTGCAAGCCTTGTCTGATG -3' R: 5'- AAGTCGATCATTGTGTGGACC -3' Yohei KOIDE et al.(2009) [85] Pi37 RM543 F: 5'- CTGCTGCAGACTCTACTGCG -3' R: 5'- AAATATTACCCATCCCCCCC -3' Shen Chen et al (2005) [75] Pi39 RM27933 F: 5'- TCCTCTGTCATATGGCTGTAAACG -3' R: 5'- GGACAAGGAGGAACTATTGATTGG -3' Xinqiong Liu et. at (2007) [83] Các trình t m i này c ng đã đ c ki m tra các thông s Tm, c u trúc th c p, đ đ c hi u trên lý thuy t… T t c các thông s đi u n m trong tiêu chu n cho phép, đ m b o kh
n ng nhân b n t t nh t c a m i và đ c ki m tra d a trên đ́nh gí s b marker liên k t v i v̀ng gen quan tâm.
29
V t li u s d ng cho xây d ng quy tr̀nh nh n di n gen qui đ nh h̀m l ng amylose B ng 2.5. Ćc m u ĺa đ c s d ng đ nghiên c u t́nh n đ nh c a marker
liên k t v i gen Waxy qui đ nh h̀m l ng amylose
STT KH Hàm l ng amylose (%) Nhóm Amylose 1 AMP1 35,01 ± 2,33 Cao 2 AMP2 38,40 ± 1,56 Cao 3 AMP3 14,89 ± 0,06 Th p 4 AMP4 15,58 ± 0,66 Th p 5 AMP5 29,28 ± 0,97 Cao 6 AMP6 30,30 ±3,08 Cao 7 AMP7 34,24 ± 2,38 Cao 8 AMP8 34,18 ± 1,02 Cao 9 AMP9 14,68 ± 1,38 Th p 10 AMP10 14,19 ± 2,48 Th p 11 AMP11 19,92 ± 2,89 Th p 12 AMP12 33,28 ± 1,96 Cao 13 AMP13 17,05 ± 1,61 Th p 14 AMP14 34,95 ± 0,45 Cao 15 AMP15 35,26 ± 1,5 Cao 16 AMP16 24,10 ± 2,26 Trung bình 17 AMP17 22,45 ± 1,03 Trung bình 18 AMP18 23,34 ± 1,15 Trung bình 19 AMP19 22,00 ± 0,96 Trung bình 20 AMP20 20,80 ± 1,14 Trung bình 21 AMP21 35,04 ± 1,53 Cao 22 AMP22 21,28 ± 0,52 Trung bình 23 AMP23 20,74 ± 1,03 Trung bình 24 AMP24 31,00 ± 2,96 Cao 25 AMP25 23,72 ± 2,51 Trung bình 26 AMP26 20,44 ± 0,40 Trung bình 27 AMP27 23,99 ± 0,14 Trung bình 28 AMP28 24,36 ± 1,16 Trung bình 29 AMP29 35,29 ± 2,89 Cao 30 AMP30 23,66 ± 0,59 Trung bình 31 AMP31 36,96 ± 0,78 Cao 32 AMP32 35,27 ± 0,61 Cao 33 AMP33 35,35 ± 1,58 Cao 34 AMP34 33,57 ± 0,13 Cao
30 35 AMP35 32,48 ± 3,48 Cao 36 AMP36 25,77 ± 1,47 Trung bình 37 AMP37(BVN) 32,28 ± 1,7 Cao 38 AMP38 (OM6162) 15,74 ± 0,48 Th p 39 AMP39 (OM4900) 15,06 ± 0,42 Th p 40 AMP41 21,67 ± 1,23 Trung bình 41 AMP42 (RVT) 18,02 ± 1,47 Th p 42 AMP43 19,47 ± 1,24 Th p 43 AMP44 32,34 ± 0,97 Cao CV (%) 3,78 F ** Gi i th́ch:** Ệh́c bi t r tć ́ ngh a m c 1%.
Ćc d̀ng ệ́a ć ngu n g c t ngu n gi ng c a SRC, đụ đ c đ́nh gí hàm ệ ng amyệosỀ b ng ph ng ph́p sinh h́a th c hi n t i ph̀ng th́ nghi m marỆỀr tr c thu c SRC, thỀo qui trình chu n và so śnh v i b ng 1.10 đ́nh gí hàm ệ ng amyệosỀ.
M i s d ng cho nghiên c u:
Trong nghiên c u này, chúng tôi s d ng ćc c p m i SSR RM190 cho x́c đ nh ki u gene