1. 5 Tình hình nghiên cứu về chi Hedychium tại Việt Nam
2.3.THỰC NGHIỆM
2.3.1. Mẫu thực vật và phương pháp xử lí:
Nguyên liệu thân rễ cây ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) đƣợc Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình ở Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam cung cấp và giám định. Mẫu thân rễ ngải tiên bousigon đƣợc lấy tại tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 4 năm 2011. Sau khi thu mua về, mẫu đƣợc rửa sạch đất cát, loại bỏ phần thối rữa, hƣ hỏng và thái ngang thân rễ thành lát dày 1- 3 mm, rồi nghiền thành bột cỡ hạt 1 – 2 mm và bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành nghiên cứu.
- Từ 0,2 kg nguyên liệu khô đã chuẩn bị cho nghiên cứu phần tinh dầu.
34
2.3.2. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon.
a/ Cho 0,2 kg nguyên liệu (đã chuẩn bị ở phần 2.3.1) cùng 2,5 lít dung dịch NaCl 10% cho vào bình cất A của thiết bị chƣng cất đặc biệt (hình 2.1) có bẫy tinh dầu D bằng 60ml dung môi toluen.
Hình 2.1: Thiết bị cất cuốn hơi nƣớc hồi lƣu. Đun hồi lƣu 03 giờ, lấy toluen trong bẫy ra và cất lấy dịch dầu – nƣớc cho đến khi âm tính với KmnO4 0,2%.
b/Bão hòa dịch dầu-nƣớc cất đƣợc bằng NaCl rồi chiết 03 lần bằng toluen mỗi lần 100ml.
c/ Gộp lƣợng toluen lấy trong bẫy chiết với lƣợng dịch chiết toluen từ dịch dầu nƣớc,, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi, thu hồi tinh dầu, giữ trong lọ kín và bảo quản trong tủ lạnh trƣớc khi xác định thành phần hoá học và các nghiên cứu khác. Hàm lƣợng tinh dầu đƣợc tính bằng tỉ lệ phần trăm khối lƣợng tinh dầu trên khối lƣợng mẫu khô (gam). Kết quả đƣợc 0,5g tinh dầu. Tính hiệu suất là 0,25%. Tinh dầu có màu vàng chanh nhạt, mùi thơm dễ chịu, hấp dẫn.
2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon: bousigon:
Mẫu tinh dầu củ ngải tiên bousigon đƣợc phân tích trên thiết bị GC-MS (HP- 6890), cột tách HP-5 (Cross-linked 5% ME Siloxane) 30m 0,25mm 0,25m Film thickness, khí mang He, tốc độ dòng 20ml/phút, Detector MSD-HP-5973, nhiệt độ
A: Bình cất B: Ống nối C: Sinh hàn D: Bẫy tinh dầu E: Khóa
35
250oC, chế độ phân tích Split Ratio 150/l; chạy theo chƣơng trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 90o
C trong 5 phút, tốc độ tăng nhiệt 5o
C/phút, nhiệt độ cuối 280o
C cho đến lúc đƣờng nền phẳng.
Thành phần các hợp chất trong tinh dầu đƣợc xác định bằng cách so sánh phổ khối của chúng với phổ chuẩn trong thƣ viện máy với độ trùng lặp trên 90%.
Hàm lƣợng các thành phần đƣợc tính toán dựa trên mối liên hệ giữa diện tích pic và lƣợng chất, kết hợp việc so sánh diện tích pic của các chất trong mẫu. Kết quả phân tích đƣợc chỉ ra trên bảng 3.1 phần kết quả thảo luận.
2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon : bousigon :
a/ Từ 3,6 kg nguyên liệu tƣơi đã chuẩn bị ở phần 2.3.1, ngâm vào 10 lít etanol 96% trong ba ngày, lọc Busne, ngâm tiếp 2 lần nữa, mỗi lần 1,5 lít EtOH 96% lọc Busne. Gộp dịch chiết etanol, thu đƣợc 10 lít dịch lọc.
b/ Cô dịch lọc bằng cách đun cách thủy đến còn 1/6 thể tích . Thêm vào 4 thể tích nƣớc bão hòa muối và chiết 3 lần bằng n – hexan.
Lần 1 : 150 ml Lần 2: 150 ml Lần 3: 150 ml.
Gộp dịch chiết n – hexan, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi bằng cách thủy thu đƣợc cặn H, 3gam. Hiệu suất 0.088% tính theo nguyên liệu tƣơi.
c/ Sau khi chiết bằng n – hexan, dịch đƣợc chiết tiếp bằng diclometan, cũng tiến hành 3 lần, mỗi lần 100 ml, thu đƣợc dịch diclometan. Làm khô bằng Na2SO4
khan, cất cách thủy để loại dung môi thu đƣợc cặn C khối lƣợng 4 gam, hiệu suất 0.11 % tính theo nguyên liệu tƣơi.
d/ Sau khi chiết bằng diclometan, dịch đƣợc chiết tiếp bằng etylaxetat, cũng tiến hành 3 lần, mỗi lần 100 ml, thu đƣợc dịch etyaxetat. Làm khô bằng Na2SO4 khan, cất cách thủy để loại dung môi thu đƣợc cặn E khối lƣợng 1 gam, hiệu suất 0.027 % tính theo nguyên liệu tƣơi
36
2.3.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity)
Theo phƣơng pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink (1994) tiến hành trên phiến vi lƣợng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampixilin, Tetracylin, Amphoterilin B và Nystatin.Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm các nhóm:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922);Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Vi khuẩn Gr (+) : Bacillus subtillis (ATCC 27212); Staphylococcus aureus (ATCC 12222)
- Nấm mốc : Aspergillus niger (439); Fusarium oxysporum (M42).
- Nấm sợi : Candida albicans (ATCC 7754); Saccharomyces cerevisiae (SH20) Nấm và vi khuẩn đƣợc duy trì trong môi trƣờng dinh dƣỡng: Trupcase soya borth (TBS) cho vi khuẩn, Saboruaud dextrose borth cho nấm. Các chủng kiểm định đƣợc hoạt hóa trƣớc khi tiến hành thử nghiệm trong môi trƣờng dinh dƣỡng dịch thể (24h đối với vi khuẩn; 48h đối với nấm ).
Mẫu thử đƣợc hòa tan hoàn toàn trong dung dịch DMSO 100%; 4 – 10 thang nồng độ sẽ đƣợc pha loãng ra từ dịch gốc rồi nhỏ vào phiến vi lƣợng. Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hóa đƣợc hòa loãng bằng môi trƣờng dinh dƣỡng cho có nồng độ 0 đơn vị McLand (khoảng 108
vi sinh vật/ml ), ủ ấm 370C/24h cho vi khuẩn; 300C/48h cho nấm.
Các thử nghiệm đƣợc tiến hành tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viên Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
2.3.6. Khảo sát các cặn chiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
- Chuẩn bị bản mỏng: hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung môi dùng để chiết sao cho dung dịch thu đƣợc không quá loãng hay quá đặc. Dùng capilla thủy tinh lấy chất rồi chấm lên bản mỏng sao cho vệt chất phải tròn, gọn, cách mép bên của bản mỏng 0,5cm, cách chân bản mỏng 0,7cm. Chiều dài bản mỏng 7cm
37
- Chuẩn bị dung môi: Pha hệ dung môi thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám và lắc kĩ. Lƣợng dung môi lấy sao cho khi triển khai sắc kí lớp mỏng không để cho dung môi ngập vết chất.
- Triển khai sắc ký bản mỏng: cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng đƣợc đặt nghiêng một góc 150. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến dung môi cách mép trên 0,1 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó hiện vệt chất bằng các thuốc hiện thích hợp.
Tiến hành SKLM cặn H trên bản 60F254 (Merk) với hệ dung môi n- hexan/EtOAc tỉ lệ 9:1,v/v, hiện sắc phổ bằng vanilin/H2SO4 1%, bằng dung dịch FeCl3 1M (pH 4) nguội và hơ nóng.
Thực hiện tƣơng tự với cặn C với hệ dung môi n-hexan/diclometan tỉ lệ thể tích 1/9, kết quả cho ở bảng 3.4 và 3.5 phần kết quả và thảo luận.
2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết chiết
2.3.7.1. Phân lập các chất trong cặn chiết n-Hexan.
Để phân lập các chất từ cặn chiết n-hexan chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sắc kí cột .
a) Chuẩn bị mẫu chất phân tách:
Hòa 2 gam cặn chiết từ n-hexan ( cặn H) vào một lƣợng n-hexan đủ để tan hết, cho thêm 3 gam silica gel cỡ hạt 40-60 m, trộn kỹ, làm khô hết dung môi.
b) Chuẩn bị cột:
Cột thủy tinh có = 3 cm, l = 70 cm, có khoá và nút thuỷ tinh ở đầu và cuối cột đƣợc rửa sạch bằng axit sunfocromic, nƣớc, axeton, sấy khô. Cho 100g silica gel cỡ hạt 40 – 60 m vào 250 ml n- hexan, khuấy đều và đổ vào cột, gõ cột đến khi không còn bọt khí. Để ổn định cột đến hơn 4 tiếng mới sử dụng.
38
Mở khóa để dung môi trong cột xuống ngang mặt chất hấp phụ, cho hỗn hợp chất phân tách đã chuẩn bị (phần a) lên cột rồi cho dung môi rửa cột đến ngập chất, xử lí để loại bỏ hết bọt khí, cho một lớp bông Silica gel mỏng để giữ yên bề mặt cột. Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ 9/1 theo thể tích với tốc độ 20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf
và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH 4), các phân đoạn có thành phần giống nhau đƣợc gộp lại với nhau và đem cất đuổi dung môi để thu chất.
- Với các phân đoạn chỉ cho một vệt chất đƣợc coi là chất sạch, nếu là chất rắn thì kết tinh lại để thu đƣợc chất tinh khiết, nếu là chất lỏng thì cất lại để thu chất tinh khiết.
- Với các phân đoạn có 1 – 3 vệt và ∆Rf nhỏ thì khảo sát lại bằng SKLM để tìm hệ dung môi thích hợp và tiến hành sắc kí cột lại để phân lập các chất tinh khiết. Bằng cách này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm và đƣợc kết quả nhƣ sau:
Từ phân đoạn 100 đến phân đoạn 160 thu đƣợc một vệt tinh khiết, cô đuổi dung môi đƣợc chất rắn kí hiệu là HB5, khối lƣợng 0,30 g, Rf = 0,79 (hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4. Với thuốc thử FeCl3 khi để nguội không màu còn khi hơ nóng có màu xanh đen.
Từ phân đoạn 50 đến phân đoạn 70 với hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 8.5/1.5, chấm trên bản mỏng cho 3 vệt rất gần nhau có Rf = 0,52; 0,72 và 0,80. Cô đuổi hết dung môi thu đƣợc dạng tinh thể lẫn dầu (bẩn). Tiếp tục tiến hành chạy cột tinh với phân đoạn này. Trộn cặn của phân đoạn 3 với 1 lƣợng silica gel vừa đủ, sấy dƣới ánh sáng tử ngoại đến khô kiệt.
Cột tinh loại nhỏ = 1 cm, l = 15 cm đƣợc nhồi ƣớt với 14 gam silica gel hòa trong hexan. Cho chất lên cột và hệ dung môi chạy cột hexan: EtOAc là 9,5:0,5. Thử SKLM với hệ dung môi triển khai 9:1. Thuốc hiện màu là vanilin thu đƣợc 3 phân đoạn có sắc phổ giống nhau.
39
Phân đoạn 16 đến phân đoạn 18 (Rf = 0,73 màu vàng sáng). Kí hiệu HB1. Phân đoạn 22 đến phân đoạn 26 (Rf = 0,65, màu vàng). Kí hiệu HB2. Phân đoạn 30 đến phân đoạn 32 (Rf ≈ 0,45 màu tím xanh). Kí hiệu HB3 . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cô đuổi dung môi các phân đoạn thu đƣợc tinh thể HB1, HB2; chất dầu là HB3.
Kiểm tra lại SKLM, thuốc thử FeCl3 thì HB3 cho màu xanh đen khi hơ nóng.
2.3.7.2. Phân lập các chất trong cặn chiết diclometan:
Làm tƣơng tự nhƣ phần 2.3.7.1 đối với 2 g cặn C.
Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan /diclometan tỉ lệ 1/9 theo thể tích với tốc độ 20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf
và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH= 4). Phân đoạn từ 92 đến phân đoạn 136 sau khi hứng dung môi từ cột, thử SKLM với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% trên bản mỏng thấy xuất hiện các chấm tròn màu tím, hơ nóng màu đen, giống nhau Rf = 0,76 trong hệ dung môi CH2Cl2/CH3OH theo tỷ lệ thể tích 7/3, tiến hành cất đuổi dung môi thu đƣợc một dạng keo dẻo. Kết tinh lại trong axeton đƣợc tinh thể màu trắng. Kí hiệu là HB7.
2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu được.
Hợp chất HB3, dạng dầu không màu, Rf =0,45 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) khi nóng. Phổ IR của HB3 max,cm-1 3086, 1681, 954 và 860. EIMS , m/z = 331,7 (M+). 13C-NMR (500 MHz,250 MHz), chuẩn nội TMS, CDCl3. Số liệu đƣợc ghi trên bảng 3.6
HB5 là chất rắn, không màu, khối lƣợng 50 mg, Rf = 0,79 (hệ dung môi n- hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. Với thuốc thử FeCl3 khi để nguội không màu còn khi hơ nóng có màu xanh đen. Phổ IR: 3636, 3083, 2932, 2855, 1758, 1674, 948, 892. EIMS (m/z) [M+]: 318. Số liệu phổ
1
H (500MHz) và 13C-NMR(125MHz) với chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3. Số liệu đƣợc ghi trên bảng 3.7
40
Hợp chất HB7, chất rắn không màu, Rf =0,76 (CH2Cl2 /CH3OH 7/3, v/v), hiện màu đen với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% khi nóng. Phổ IR của HB7 max,cm-1 3542.06, 1710.80, 1073.52 và 983.28. EIMS , m/z = 387,4 (M+). 13C-NMR (500 MHz,250 MHz), chuẩn nội TMS, MeOH. Số liệu đƣợc ghi trên bảng 3.8.
2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được:
Theo phƣơng pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI) và trƣờng đại học Dƣợc, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Dòng tế bào
Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thƣ gan) Lu (Lung cancer - Ung thƣ phổi)
Dòng RD (ung thƣ cơ vân tim - Rhabdosarcoma) từ Viện VSDT TƢ
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) Có bổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)
Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lƣợng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO
- Đọc trên máy ELISA ở bƣớc sóng 495-515nm
Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:
41
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đƣợc đƣa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử đƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(xi - x )2 =
n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang gía trị logarit của đƣờng cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y=a+blnX
Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%). Đồ thị tính giá trị IC50 của mẫu
42
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đối tượng và đề tài nghiên cứu:
Nhƣ phần tổng quan đã trình bày NF-κB hoạt hóa là nguyên nhân của bệnh ƣng thƣ và nhiều bệnh khác. Trong những năm đầu thế kỉ 21 này ngƣời ta phát hiện ra rằng các γ-lacton-α,β không no dãy labdan ditecpen không những có tác dụng ức chế sự tạo thành của NF-κB hoạt động mà nó còn có tác dụng loại trừ sự hoạt động của NF-κB. Chính vì vậy chúng là chất có hoạt tính chống ƣng thƣ mạnh, là đối tƣợng nghiên cứu của các nhà khoa học tiên tiến trên thế giới và cũng là đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi. Các công bố mới nhất cho thấy các loài thuộc chi Ngải (Hedychium) là nguồn nguyên liệu cho hợp chất γ-lacton-α,β không no dãy labdan ditecpen.
Các năm trƣớc chúng tôi đã nghiên cứu các γ-lacton-α,β không no dãy labdan và hoạt tính gây độc tế bào ƣng thƣ trong thân rễ cây ngải tiên (Hedychium coronarium Koen) [6]. Nhằm hoàn thiện nghiên cứu hóa học các loài thuộc chi Hedychium và tìm kiếm các γ-lacton-α, β không no dãy labdan ditecpen chúng tôi tiến hành nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh hoạt trong cây ngải tiên Bousigon với đề tài:― Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học
trong thân rễ cây ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ‖ . Đối tƣợng chúng tôi nghiên cứu là thân rễ cây ngải tiên bousigon đƣợc
thu mua vào tháng 4/2011 tại Vĩnh Phúc. Mẫu cây do TS. Nguyễn Quốc Bình– cán bộ của Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, ngƣời có bề dày thâm niên nghiên cứu họ